平菇多糖制備技術(shù)_生物工藝學(xué)實(shí)驗(yàn)指

綜合實(shí)驗(yàn)十　平菇多糖制備技術(shù)

一、背景知識(shí)

（一）食用菌的應(yīng)用價(jià)值

食用菌具有低脂肪、低熱量、多藥效、口感滑膩和味道鮮美的特點(diǎn)，富含蛋白質(zhì)、多種維生素、礦物質(zhì)和膳食纖維，自古被視為“山珍”。中國的各大傳統(tǒng)菜系中，都有用食用菌烹調(diào)的名饌佳肴。國外科學(xué)家對(duì)食用菌的營養(yǎng)和保健功效給予了很高的評(píng)價(jià)，認(rèn)為菇類具備了食品的一切良好特性。食用菌生產(chǎn)過程很少噴施農(nóng)藥和使用化肥，是綠色有機(jī)食品的典范。在美國，食用菌被稱為“上帝食品”；在日本，食用菌被稱為“植物性食品的頂峰”；在歐洲，食用菌則有“蔬菜皇后”“植物肉”“素中之葷”之美譽(yù)。食用菌被營養(yǎng)學(xué)家認(rèn)定為世界十大健康食品之一。中國為世界第一大食藥用真菌生產(chǎn)國，食用菌產(chǎn)業(yè)地位僅次于糧、棉、油、果和蔬菜，位居第六。隨著人們對(duì)食用菌營養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值認(rèn)識(shí)的提高以及食用菌生產(chǎn)所帶來的經(jīng)濟(jì)效益的增加，人們對(duì)食用菌產(chǎn)業(yè)化技術(shù)的研發(fā)重視程度越來越高。國內(nèi)大量栽培的品種只占我國已發(fā)現(xiàn)品種中的3%，90%多的野生品種還沒有在生產(chǎn)中得到利用。因此，人工馴化培育優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)、生長迅速、質(zhì)嫩味美、經(jīng)濟(jì)價(jià)值高、具有特色的野生食用菌品種，是目前食用菌生產(chǎn)上急需解決的問題。隨著科學(xué)的進(jìn)步，逐步由野生馴化成為現(xiàn)代人工大量栽培的各種不同特色的食用菌，成為食用菌科技工作者關(guān)注的熱點(diǎn)之一。

（二）平菇種質(zhì)資源

目前我國引進(jìn)和馴化栽培成功的食用菌品種已達(dá)80多種，由于平菇具有栽培方法簡單、成本低和產(chǎn)量高等特點(diǎn)，又富含多種氨基酸、維生素和礦物質(zhì)，是目前我國產(chǎn)量最高的食用菌種類，占我國食用菌總產(chǎn)量24%左右，是極具開發(fā)潛力和應(yīng)用前景的藥食兩用真菌。平菇是隸屬于擔(dān)子菌門（Basidiomycota）層菌綱（Hymenomycetes）傘菌目（Agaricales）側(cè)耳科（Pleurotaceae）側(cè)耳屬（Pleurotus）食用菌共用的商品名稱。平菇與其他栽培食用菌不同，它不是分類學(xué)上的單一物種，而是由糙皮側(cè)耳（Pleurotus ostreatus）、佛羅里達(dá)側(cè)耳（Pleurotus f lorida）、肺形側(cè)耳（Pleurotus pulmonarius）和白黃側(cè)耳（Pleurotus cornucopiae）4個(gè)形態(tài)特征和栽培特性都十分相似的近緣種組成的族群。糙皮側(cè)耳俗稱凍菇、北風(fēng)菇、蠔菇等，已有人將糙皮側(cè)耳稱為平菇，在我國分布廣泛，該品種栽培種質(zhì)豐富多樣，子實(shí)體一般呈覆瓦狀叢生，菌蓋色澤上有深灰、淺灰、棕灰之別，質(zhì)地上有疏松、脆嫩、緊實(shí)等不同，菌柄一般為側(cè)生或偏生。由于多年的人工選擇、引種和交流，目前栽培品種多達(dá)數(shù)十個(gè)。白黃側(cè)耳栽培品種俗稱姬菇、小平菇，子實(shí)體外觀與糙皮側(cè)耳相似，子實(shí)體密集叢生、菌蓋較小，菌蓋顏色為深灰色至淺灰色。肺形側(cè)耳的栽培品種多指鳳尾菇和秀珍菇，子實(shí)體形態(tài)呈單生或散生，菌蓋成熟后期邊緣常呈波狀，菌柄多側(cè)生。其中秀珍菇因其質(zhì)地致密、口感滑爽、清香、耐儲(chǔ)性好深受消費(fèi)者喜愛。佛羅里達(dá)側(cè)耳栽培品種俗稱白平菇或高溫白平菇，最早是由國外引進(jìn)，該品種特點(diǎn)為子實(shí)體呈放射狀叢散生，色澤為乳白色或深些。

平菇菌絲在2～40℃均可生長，環(huán)境溫度在24～28℃最適宜其生長。子實(shí)體形成溫度范圍因品種的感溫性差異而有所不同。平菇喜濕，好偏酸性生長環(huán)境，菌絲生長階段的最適濕度為60%～70%，原基分化和子實(shí)體發(fā)育時(shí)最適空氣濕度為85%～95%。平菇菌絲在pH值為4～8時(shí)均能生長，最適pH為5.8～6.2。當(dāng)pH超過8時(shí)，菌絲生長速度明顯下降并趨于停止。當(dāng)pH降至4以下時(shí)，菌絲生長也會(huì)受到明顯的抑制。子實(shí)體發(fā)育的最適pH值為5.5～6.0。平菇屬于木腐性真菌，對(duì)營養(yǎng)的適應(yīng)范圍廣，要求不太嚴(yán)格，許多富含纖維素的農(nóng)副產(chǎn)品下腳料均可作為生長基質(zhì)，生產(chǎn)上常以秸稈、玉米芯、棉籽殼、木屑等作為栽培原料。平菇栽培季節(jié)主要為春秋兩季，目前一些新品種也可夏季種植，通過人工控制環(huán)境的溫度、濕度，亦可全年工廠化種植。栽培基質(zhì)可采用生料或發(fā)酵料，可利用床栽、畦栽、袋栽、瓶栽等方式進(jìn)行種植。

（三）平菇多糖的保健作用

我國是最早將真菌應(yīng)用于藥用或養(yǎng)生保健領(lǐng)域的國家之一，春秋戰(zhàn)國時(shí)代起就有多種文獻(xiàn)和典籍記載真菌多糖的藥用和保健功效。平菇在全世界約有50種，我國是平菇種類資源較為豐富的國家之一，目前野生和引種的栽培品種已達(dá)56種，我國平菇產(chǎn)量占世界總產(chǎn)量的25%左右。平菇是目前產(chǎn)量最高、人工栽培最廣泛、與人類關(guān)系最為密切的食用真菌之一，是具有較高營養(yǎng)價(jià)值和藥食兼用價(jià)值的真菌。平菇的優(yōu)點(diǎn)主要體現(xiàn)在易于栽培、產(chǎn)量高、生產(chǎn)成本低、種植經(jīng)濟(jì)效益較高。平菇含豐富的多糖、氨基酸、微量元素、多種脂肪酸、三萜等營養(yǎng)生理活性成分，平菇多糖（Pleurotus ostreatus polysaccharide，POP）是從平菇中提取的一種重要成分，生理功能十分廣泛，具有抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、降血糖、降血壓、降血脂、抗衰老、抗氧化、抗輻射等多種藥理和保健功效。利用發(fā)酵技術(shù)可以在很短時(shí)間內(nèi)獲得大量富含活性多糖的平菇菌絲體，并從菌絲體中提取多糖。平菇多糖的研究也較為廣泛，在保健食品和功能性食品開發(fā)方面應(yīng)用廣泛，可有效增強(qiáng)人體免疫力，提高機(jī)體抗病能力，并對(duì)疾病的治療起到很好的輔助功效。近年來世界各國都開始重視真菌多糖的醫(yī)療和保健作用，將真菌多糖視為21世紀(jì)的食品。有專家預(yù)言：“在生化和藥物領(lǐng)域中，興師動(dòng)眾的蛋白質(zhì)時(shí)代即將過去，取而代之的將是多糖時(shí)代”。食藥用真菌多糖在國際上被稱為“生物反應(yīng)調(diào)節(jié)物”（Biological Response Modifier，BRM）。

（四）平菇多糖的藥理功效

1.平菇多糖的抗腫瘤作用

大多數(shù)真菌多糖，如云芝多糖、靈芝多糖、香菇多糖、黑木耳多糖、金針菇多糖、豬苓多糖、茯苓多糖、黃蘑多糖等，都具有確切的抗腫瘤活性，臨床上可用于治療多種腫瘤，其治療效果顯著。真菌多糖抗腫瘤作用機(jī)理目前尚無定論，主要是通過增強(qiáng)和恢復(fù)患者的免疫功能來實(shí)現(xiàn)其抗腫瘤作用，并且對(duì)人體無毒副作用。真菌多糖的抗腫瘤機(jī)理主要包括以下方面：促進(jìn)抗體形成，刺激或協(xié)助恢復(fù)T細(xì)胞，提高淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率，激活巨噬細(xì)胞，誘生干擾素抑制腫瘤，增加細(xì)胞中c AMP濃度，提高血清或血漿蛋白含量，升高白細(xì)胞數(shù)等。平菇含有菌糖和甘露醇糖等多種生物活性物質(zhì)，以發(fā)揮抗腫瘤、抗病毒的功效，抑制病毒素的合成和增殖。

2.平菇多糖的免疫調(diào)節(jié)作用

平菇多糖的生物活性中最主要的是免疫調(diào)節(jié)活性，作為一種免疫調(diào)節(jié)劑的真菌多糖被廣泛用于免疫性缺陷疾病、自身免疫疾病和腫瘤等的臨床治療，可通過多條途徑、多個(gè)層面對(duì)免疫系統(tǒng)發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。通過激活機(jī)體的T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞（NK）等免疫細(xì)胞，廣泛刺激機(jī)體的特異性與非特異性免疫反應(yīng)，改善機(jī)體免疫系統(tǒng)功能，提高機(jī)體免疫力，從而起到“扶正固本”的作用。近年來一些具有增強(qiáng)機(jī)體的免疫作用的真菌多糖相繼被發(fā)現(xiàn)，如黃蘑多糖、銀耳多糖、香菇多糖、靈芝多糖等。研究還顯示，平菇多糖中的葡聚糖和虎奶多糖也具有提高人體免疫力的功能。

3.平菇多糖的降血糖作用

真菌多糖能有效增強(qiáng)冠狀動(dòng)脈機(jī)能，擴(kuò)大冠體流量，增強(qiáng)心肌供氧能力，降血脂，預(yù)防動(dòng)脈硬化，改善血液循環(huán)，在降低血糖、血脂和血壓等方面都有顯著作用。當(dāng)今國內(nèi)外對(duì)平菇多糖的降血糖作用及其機(jī)制進(jìn)行了深入研究，證實(shí)平菇多糖具有良好的降血糖功效，可通過不同途徑發(fā)揮降血糖作用。真菌多糖降血糖的機(jī)制主要包括：促進(jìn)胰島素分泌，增加血清胰島素含量，改善胰島素抵抗，加速肝葡萄糖代謝，減少或減緩對(duì)葡萄糖的吸收。迄今已發(fā)現(xiàn)不少藥用真菌多糖均有降血糖作用，如云芝、靈芝、蟲草、銀耳、白木耳、黑木耳、猴頭、灰樹花、蜜環(huán)菌和金耳等多糖，食用上述真菌多糖能通過增加胰島素的分泌量、提高胰島素的利用率而降低糖尿病患者的血糖水平，對(duì)糖尿病患者健康是有益的。

4.平菇多糖的降血脂作用

研究顯示，平菇多糖能夠通過防止機(jī)體脂質(zhì)過氧化損傷而發(fā)揮其降血脂的功效，平菇中的糙皮側(cè)耳具有降脂功效已被實(shí)驗(yàn)證實(shí)，糙皮側(cè)耳中起降血脂作用的活性物質(zhì)是Mevinolin。許多真菌中含有降血脂活性成分——洛伐他汀、齊放等，在側(cè)耳屬的長柄側(cè)耳中發(fā)現(xiàn)了降血脂成分——洛伐他汀，金頂側(cè)耳甲醇提取物具有顯著的降血脂活性，研究證實(shí)金頂側(cè)耳中也有洛伐他汀的存在。

5.平菇多糖其他藥理作用

平菇多糖的藥理作用還表現(xiàn)在抗氧化、抗衰老和清除自由基的生理作用。研究還發(fā)現(xiàn)，平菇真菌多糖具有抗病毒、抗凝血、抑菌和保肝護(hù)肝等生物功效，如虎奶菌多糖對(duì)動(dòng)物的肝臟具有保護(hù)作用，對(duì)網(wǎng)狀皮系統(tǒng)也有興奮功能。平菇多糖還具調(diào)節(jié)自主神經(jīng)功能，特別是對(duì)更年期綜合征有明顯調(diào)節(jié)作用，糙皮側(cè)耳子實(shí)體殼聚糖具有較高的抑菌殺菌能力。平菇已成為食品和藥品開發(fā)的重要資源之一，其表現(xiàn)出的廣泛的營養(yǎng)價(jià)值、保健和抗病活性已成為食品工業(yè)和醫(yī)藥界關(guān)注的熱點(diǎn)。

二、實(shí)驗(yàn)簡介

隨著食用菌液體菌種深層發(fā)酵技術(shù)的興起，利用深層液體發(fā)酵技術(shù)對(duì)菌種進(jìn)行培養(yǎng)，然后再進(jìn)行人工或自動(dòng)化接種進(jìn)行固體栽培，或直接從菌絲體中提取具有生物活性的物質(zhì)已經(jīng)成為行業(yè)熱點(diǎn)。與固體發(fā)酵生產(chǎn)食用菌子實(shí)體相比，食用菌的液體深層發(fā)酵進(jìn)行菌種培養(yǎng)具有如下優(yōu)勢：

（1）生產(chǎn)周期大大縮短，生產(chǎn)管理更規(guī)范；

（2）利用液體種子代替固體種子，菌齡一致性更高，接種更方便，便于自動(dòng)化生產(chǎn)；

（3）便于通過代謝調(diào)控，大量獲得所需的次生代謝產(chǎn)物，產(chǎn)率和生產(chǎn)效率更高。一些尚不能人工栽培的野生菌（比如冬蟲夏草）可通過液體深層發(fā)酵獲得目的產(chǎn)品或特定活性物質(zhì)，便于工業(yè)化量產(chǎn)，已有50余種食藥用真菌可采用深層發(fā)酵技術(shù)進(jìn)行培養(yǎng)。

利用深層液體發(fā)酵技術(shù)進(jìn)行平菇的生產(chǎn)，生產(chǎn)效率更高，更容易進(jìn)行工業(yè)化和規(guī)?；a(chǎn)，也是平菇生產(chǎn)的發(fā)展趨勢。如果利用液體深層發(fā)酵技術(shù)培養(yǎng)平菇是為了栽培獲得子實(shí)體，則液體發(fā)酵結(jié)束后短時(shí)間內(nèi)在無菌條件下接種并進(jìn)行固體栽培即可。如為獲得平菇多糖（或其他代謝物質(zhì)），可將深層發(fā)酵培養(yǎng)獲得的平菇菌絲體，經(jīng)過過濾、離心、真空蒸發(fā)、沉淀、吸附、干燥等處理工序，將多糖產(chǎn)物濃縮獲得粗多糖，也可進(jìn)一步純化為商品。

本實(shí)驗(yàn)分為三部分，第一部分為平菇液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)條件的確定；第二部分為平菇液態(tài)培養(yǎng)的結(jié)果分析和測定；第三部分小型發(fā)酵罐中進(jìn)行產(chǎn)品的分批發(fā)酵。這三部分的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容涵蓋了平菇液體發(fā)酵工藝條件的確定方法、發(fā)酵產(chǎn)物——多糖的測定、小型發(fā)酵罐的使用方法及利用小型發(fā)酵罐對(duì)平菇進(jìn)行分批發(fā)酵的工藝操作。通過這三部分內(nèi)容的學(xué)習(xí)和實(shí)踐，可為今后利用發(fā)酵罐對(duì)食用菌進(jìn)行深層液體發(fā)酵工業(yè)化生產(chǎn)奠定理論和實(shí)踐基礎(chǔ)。

實(shí)驗(yàn)10-1　平菇液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)條件的確定

平菇常規(guī)固體菌種培養(yǎng)生產(chǎn)周期長、菌齡不一致，容易帶來菌種質(zhì)量不高，且生產(chǎn)效率較低的問題。液體發(fā)酵培養(yǎng)技術(shù)可大大縮短原種或栽培種的制種時(shí)間，提高菌種的均一性和生產(chǎn)效率。在液體培養(yǎng)中，菌絲體新陳代謝旺盛，菌絲生長分裂迅速，能在短時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生大量的菌絲體（菌種），液體菌種接入固體培養(yǎng)料時(shí)，又具有流動(dòng)快、易分散、萌發(fā)快、發(fā)菌點(diǎn)多等特點(diǎn)。菌種可進(jìn)行自動(dòng)化、工業(yè)化和規(guī)?；a(chǎn)，生產(chǎn)周期短，菌齡整齊。平菇多糖等代謝物質(zhì)亦可從液體發(fā)酵培養(yǎng)的菌絲體里面直接分離純化。發(fā)展平菇液體培養(yǎng)技術(shù)前景廣闊。

（一）實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

1.掌握微生物斜面培養(yǎng)基、種子培養(yǎng)基及發(fā)酵培養(yǎng)基確定方法，學(xué)會(huì)對(duì)已知菌種確定實(shí)驗(yàn)室發(fā)酵工藝。

2.篩選平菇最適生長及產(chǎn)物形成的營養(yǎng)條件和培養(yǎng)條件，確定特定產(chǎn)物發(fā)酵的最適工藝參數(shù)。

（二）實(shí)驗(yàn)材料

1.菌種

平菇（Pleurotus ostreatus）。

2.儀器設(shè)備

天平、電爐、烘箱、恒溫振蕩培養(yǎng)箱。

3.玻璃儀器

三角瓶（棉塞）、接種鏟、試管菌種、燒杯500mL、量筒100mL等。

4.培養(yǎng)基原料

土豆、葡萄糖、蛋白胨、酵母粉、玉米粉、瓊脂、KH2PO4、mgSO4、CaCl2、維生素B1等。

（三）實(shí)驗(yàn)方法與步驟

1.培養(yǎng)基配置（正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)——培養(yǎng)基成分）

2.接種

3.培養(yǎng)（正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)——培養(yǎng)條件確定）

4.結(jié)果觀察、檢測

菌絲球直徑、菌絲體積、生物量——比濁法和直接稱重法、總糖、還原糖的測定等。

表1-10-1　培養(yǎng)基正交試驗(yàn)因子水平

表1-10-2　正交試驗(yàn)方案與結(jié)果

表1-10-3　培養(yǎng)條件正交試驗(yàn)因子水平

表1-10-4　正交實(shí)驗(yàn)方案與結(jié)果

（四）實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

1.如何通過設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)確定食用菌液態(tài)發(fā)酵的培養(yǎng)條件。

2.根據(jù)所查資料說明接種量、裝液量、溫度和振蕩速度對(duì)培養(yǎng)結(jié)果的影響。

實(shí)驗(yàn)10-2　平菇液態(tài)培養(yǎng)的結(jié)果分析和測定

（一）實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

1.學(xué)習(xí)液態(tài)培養(yǎng)結(jié)果觀察。

2.掌握絲狀真菌液態(tài)培養(yǎng)的生物量的測定和總糖、還原糖的測定方法。

（二）實(shí)驗(yàn)材料

1.儀器設(shè)備

天平、電爐、烘箱、紫外分光光度計(jì)、離心機(jī)。

2.玻璃儀器及其他

平菇培養(yǎng)搖瓶種子、接種鏟、表面皿、洗瓶、刻度離心管、刻度尺等。

（三）實(shí)驗(yàn)方法與步驟

1.菌絲球直徑和菌絲體體積的測量

直徑：由刻度尺直接測得；體積：用刻度離心管離心后測得。

2.生物量的測定

（1）原理

生物量的測定方法有比濁法和直接稱重法等。酵母在液體深層通氣發(fā)酵過程中是以均一渾濁液的狀態(tài)存在的，可以采用直接比色法進(jìn)行測定。而絲狀真菌則一般用直接稱重法測定其生物量。

（2）實(shí)驗(yàn)步驟

取發(fā)酵液在3000r/min離心10min，棄上清液。水洗，離心10min，沉淀稱濕重和干重。

（四）多糖的測定——苯酚-硫酸法

1.原　理

此法通過制備顯色溶液在紫外分光光度計(jì)上進(jìn)行光度測定。苯酚-硫酸為此法中所用到的試劑，另外還包括葡萄糖溶液（作標(biāo)液）、樣品（作樣品液）、乙醇（使多糖沉淀）。

食品中分子量＞10000的高分子物質(zhì)（多糖）在80%乙醇溶液中沉淀，與水溶性單糖和低聚糖分離，粗多糖在硫酸的作用下水解成單糖，并迅速脫水生成糖醛衍生物，與苯酚縮合成有色化合物，用分光光度法測定樣品粗多糖含量。

2.實(shí)驗(yàn)步驟

（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

①標(biāo)準(zhǔn)液制備

精密吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)使用溶液（40mg/L）0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.5，2.0mL分別置于0號(hào)、1號(hào)、2號(hào)、3號(hào)、4號(hào)、5號(hào)、6號(hào)、7號(hào)試管中，加蒸餾水到2mL，各加入苯酚溶液1.0mL，在旋轉(zhuǎn)混勻器上混勻，在冰水浴中小心加入濃硫酸5.0mL，于旋轉(zhuǎn)混勻器小心混勻，置沸水浴中煮沸10min，冷卻后用分光光度計(jì)在490nm波長處以試劑空白溶液為參比，1cm比色皿測定吸光度值。

②標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

以0號(hào)管為空白，在分光光度計(jì)上測定1—7號(hào)管的吸光度值。以吸光度值為縱坐標(biāo)，葡萄糖毫克數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

表1-10-5　苯酚-硫酸法標(biāo)準(zhǔn)曲線制作參考表

（2）樣品液制備

①提取

精密稱取混合均勻的含粗多糖樣品4.0g，置于100mL容量瓶中，加水80mL左右，于沸水浴上加熱2h，冷卻至室溫后補(bǔ)加水至刻度，混勻、過濾，濾液供沉淀多糖。

②沉淀粗多糖

精密取液體樣品5.0mL（即被測多糖是液體而不是固體樣品）置于50mL離心管中，加入無水乙醇至90%，混勻后以4000r/min離心10min，棄去上清液。沉淀后用80%乙醇溶液數(shù)毫升洗滌，離心后棄去上清液，反復(fù)3～4次操作。接下來沉淀，用水溶解并定容至50mL，混勻后供沉淀葡聚糖。

③測定

精密取樣品測定液2.0mL置于25mL比色管中，加入苯酚溶液1.0mL，在旋轉(zhuǎn)混合器上混勻后，在冰水浴中小心加入濃硫酸5.0mL后于旋轉(zhuǎn)混合器上混勻后，置于水浴中煮沸10min，冷卻至室溫，用分光光度計(jì)在490nm波長處，以試劑空白為參比，1cm比色皿測定吸光度值。

以上步驟必須做3個(gè)重復(fù)。

（3）計(jì)算

取樣品液中3個(gè)重復(fù)的平均吸光度值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出相應(yīng)的葡萄糖毫克數(shù)，可求出發(fā)酵液中總多糖的含量。

（五）實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

1.比較平菇靜置培養(yǎng)和搖瓶培養(yǎng)的菌絲球直徑和生物量的變化，試分析產(chǎn)生其變化的可能的原因。

2.結(jié)合實(shí)驗(yàn)一，談?wù)勂焦揭簯B(tài)培養(yǎng)的體會(huì)，分析實(shí)驗(yàn)成功或失敗的原因和收獲。

實(shí)驗(yàn)10-3　小型發(fā)酵罐中平菇的分批發(fā)酵

發(fā)酵罐（生物反應(yīng)器）是發(fā)酵工程的重要組成部分，是利用發(fā)酵技術(shù)將原料轉(zhuǎn)化為產(chǎn)品的關(guān)鍵設(shè)備，在發(fā)酵工程中處于中心地位。機(jī)械攪拌式發(fā)酵罐，是進(jìn)行液體發(fā)酵的特殊設(shè)備。實(shí)驗(yàn)室使用的小型發(fā)酵罐，其容積可從1L至數(shù)百升。一般來說，10L以下的發(fā)酵罐是用耐壓玻璃制作的罐體，10L以上用不銹鋼板或鋼板制作罐體。發(fā)酵罐配備有控制器和各種電極，可以自動(dòng)調(diào)控試驗(yàn)所需的培養(yǎng)條件，是微生物學(xué)、遺傳工程和醫(yī)藥工業(yè)等科學(xué)研究所必需的設(shè)備。

（一）實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

1.認(rèn)識(shí)發(fā)酵罐的結(jié)構(gòu)與功能，反應(yīng)前的安裝和準(zhǔn)備，反應(yīng)后的拆卸和清洗等。

2.分別了解pH電極和溶氧電極（DO）的結(jié)構(gòu)和基本原理；掌握pH電極和溶氧電極的校正方法。

3.掌握發(fā)酵罐培養(yǎng)基的在位滅菌與離位滅菌；認(rèn)識(shí)反應(yīng)器在位高壓滅菌的方法和規(guī)程，學(xué)會(huì)對(duì)反應(yīng)器培養(yǎng)液滅菌過程中的升溫、保壓、降溫和培養(yǎng)溫度的設(shè)定等的操作。

4.掌握發(fā)酵罐接種的方法及操作流程，確保發(fā)酵液無雜菌污染；掌握pH調(diào)節(jié)劑和消泡劑的流加方法。

5.學(xué)會(huì)從發(fā)酵罐中定時(shí)取出樣液的方法。并掌握正確使用發(fā)酵罐發(fā)酵生產(chǎn)的方法，從而可對(duì)中試及中試以上的發(fā)酵生產(chǎn)研究有一個(gè)初步的概念和感性認(rèn)識(shí)。

6.根據(jù)微生物生長的基本特點(diǎn)，引導(dǎo)學(xué)生對(duì)從菌體萌發(fā)到衰亡的整個(gè)生長過程有一個(gè)全面實(shí)際的認(rèn)識(shí)，并在此基礎(chǔ)上測繪菌體的生長曲線，同時(shí)根據(jù)測繪結(jié)果，計(jì)算對(duì)數(shù)生長期的比生長速率。

7.了解測定生物量的基本方法（細(xì)胞計(jì)數(shù)法、生物量濕重法和干重法、濁度測定法、離心壓縮細(xì)胞體積法）。

（二）實(shí)驗(yàn)原理

圖1-10-1　BIOF6010微生物發(fā)酵罐

各廠家生產(chǎn)的發(fā)酵罐會(huì)有所差別，但基本原理是相同的?，F(xiàn)以上海理工大學(xué)出廠的5L罐為例，說明小型發(fā)酵罐的結(jié)構(gòu)。發(fā)酵罐的結(jié)構(gòu)可分為罐體和控制器兩部分，如圖1-10-1。

發(fā)酵實(shí)驗(yàn)的正常運(yùn)行需要三部分結(jié)構(gòu)，分別為：罐體和控制箱、空氣壓縮機(jī)（空壓站）和蒸汽發(fā)生器（鍋爐房），這里主要介紹罐體和控制箱。

罐體為一硬質(zhì)玻璃圓筒，底和頂兩端用不銹鋼板及橡膠墊圈密封構(gòu)成，容積為5L，頂蓋上有幾個(gè)孔口（如圖1-10-2），分別是加料及接種口、放置溫度計(jì)口、補(bǔ)料口、放置DO（溶解氧）氧電極口、放置溫度電極口、放置pH電極口、放置消泡電極口、放置取樣管口、放置攪拌器及冷凝管口。

圖1-10-2　發(fā)酵罐頂蓋及各孔口

1.加料及接種口；2.放置溫度計(jì)口；3.補(bǔ)料口；4.放置DO（溶解氧）電極口；5.放置溫度電極口；6.放置pH電極口；7.放置消泡電極口；8.放置取樣管口；9.放置攪拌器及冷凝管口

發(fā)酵罐放置在罐座上，罐座除支持發(fā)酵罐外，還有攪拌器轉(zhuǎn)動(dòng)裝置、升溫和冷卻裝置等。

控制器能夠完成基本的控制功能，它由下列幾部分構(gòu)成：

（1）參數(shù)輸入及顯示裝置：用于輸入控制發(fā)酵條件的各種參數(shù)及顯示發(fā)酵過程中罐內(nèi)培養(yǎng)液的溫度、pH、DO（溶解氧）的測定數(shù)值。

（2）電極校正裝置：用以校正pH電極和DO電極等。

（3）酸堿泵：用以向發(fā)酵罐加入酸液（或生理酸性物質(zhì)）、堿液（或生理堿性物質(zhì)）以調(diào)節(jié)培養(yǎng)液中的pH。

（4）消泡劑加入泵：用于向發(fā)酵罐加入消泡劑，以消除發(fā)酵過程中產(chǎn)生的過多泡沫。

（5）報(bào)警及蜂音器按鈕：當(dāng)發(fā)酵過程中電路發(fā)生故障時(shí)，如顯示屏上顯示溫度、轉(zhuǎn)速或DO值超出本機(jī)的設(shè)定值，則顯示屏上的相應(yīng)值閃爍，并發(fā)出“嘟、嘟”聲。按此按鈕則“嘟、嘟”聲可暫時(shí)消除，但只有當(dāng)故障排除，蜂音器才能停止報(bào)警。

（6）自動(dòng)或人工控制按鈕：用以決定本控制器是處在自動(dòng)控制或人工控制狀態(tài)。

（7）電極電導(dǎo)連線：本機(jī)有8條連接導(dǎo)線，分別連接控制發(fā)酵罐的DO、pH、溫度、泡沫、轉(zhuǎn)速、電機(jī)啟動(dòng)、加熱和冷卻。

（8）空氣調(diào)節(jié)裝置：控制器的空氣調(diào)節(jié)裝置由進(jìn)氣口、出氣口、空氣減壓閥、空氣壓力表、空氣流量調(diào)節(jié)閥和空氣流量計(jì)組成，用以調(diào)節(jié)進(jìn)入發(fā)酵罐的空氣流量及壓力。進(jìn)氣管與空氣壓縮機(jī)或氧氣瓶相連；出氣管與發(fā)酵罐之間接有空氣過濾器，以濾除空氣中的微生物，避免染菌。

（三）實(shí)驗(yàn)材料

1.菌種

平菇（Pleurotus ostreatus）。

2.培養(yǎng)基

（1）斜面培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（PDA）（g/L），馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂20g，自然pH值。

（2）種子培養(yǎng)基（g/L）

①馬鈴薯200g，葡萄糖20g，自然pH值。

②葡萄糖15g，蛋白胨5g，mgSO4·7H2O 0.5g，KH2PO41g，酵母粉2g，pH 5.0。

③馬鈴薯20g，葡萄糖2g，KH2PO40.3g，mgSO4·7H2O 0.15g，pH 5.5，VB0.05%～0.1%。

（3）發(fā)酵培養(yǎng)基（%）

玉米粉1g，葡萄糖2g，酵母粉0.5g，mgSO4·7H2O 0.15g，KH2PO4· 3H2O 0.15g，pH 5.0～6.0。

（四）實(shí)驗(yàn)材料

BIOF6010型發(fā)酵罐。

（五）實(shí)驗(yàn)方法與步驟

1.菌種準(zhǔn)備

配制PDA培養(yǎng)基100mL，分裝試管，滅菌后擺成斜面。將平菇接種于斜面上，28℃培養(yǎng)72h。

2.液體深層培養(yǎng)

選用菌種，經(jīng)試管斜面活化培養(yǎng)，接種于含100mL液體培養(yǎng)基的250mL三角瓶，28℃培養(yǎng)3d。移接于含200mL液體培養(yǎng)基的500mL三角瓶，28℃培養(yǎng)2d。然后，按10%的接種量移接于裝有3.5L液體培養(yǎng)基的磁力攪拌發(fā)酵罐，連續(xù)通風(fēng)攪拌培養(yǎng)6d。放罐后，離心分離得菌絲體和發(fā)酵液。

3.發(fā)酵條件

以正交試驗(yàn)確定的培養(yǎng)基作為發(fā)酵培養(yǎng)基，裝料系數(shù)為0.7，接種量為10%，培養(yǎng)溫度為28℃，pH為5.0～6.0，通氣量為1∶1，溶氧控制在飽和度的10%以上。

（1）上罐前的準(zhǔn)備

①發(fā)酵罐的清洗

洗凈發(fā)酵罐及各個(gè)部件，洗凈各連接膠管。發(fā)酵罐內(nèi)（可進(jìn)行清洗）任何部分都應(yīng)認(rèn)真清洗，否則都可能成為雜菌的滋生地。發(fā)酵前期引起染菌的主要原因是清洗不凈。易被忽略而未能充分清洗的地方有軸封、罐頂、取樣管和空氣分布器等處。另外，還應(yīng)充分注意發(fā)酵罐周圍的附件設(shè)備，如加熱電器、空氣壓縮機(jī)、電機(jī)的安全使用。

②上罐前的各項(xiàng)檢查工作

檢查空氣源，排油；防油進(jìn)空氣過濾器造成堵塞。

檢查管道閥門（加棉團(tuán)吸油）校檢空氣減壓閥，pH和DO電極，檢查軸封。

③培養(yǎng)基滅菌

配制培養(yǎng)基2000mL，置發(fā)酵罐內(nèi)，調(diào)整pH為6.0，加消泡劑豆油0.2%～2%，121℃30min滅菌。滅菌后取出置無菌室中。

（2）上罐時(shí)的操作步驟

①把發(fā)酵罐置罐座上，連接各電極導(dǎo)線。

②接通控制器、參數(shù)輸入及顯示裝置、電極校正裝置及罐座電源。

③按控制器、參數(shù)輸入與顯示裝置上的AUTO鍵，使發(fā)酵罐處在自動(dòng)控制狀態(tài)。

④連接壓縮空氣管路，接通空氣壓縮機(jī)電源，調(diào)節(jié)貯氣罐出氣壓力為0.5～1.0MPa，通入壓縮空氣，調(diào)節(jié)空氣流量計(jì)旋鈕，使浮子懸浮在5～7L/min處。

⑤調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)速為250r/min。

⑥連接冷卻水管路，打開自來水龍頭，通入冷卻水。

⑦輸入各控制參數(shù)，本機(jī)自動(dòng)控制發(fā)酵過程中的溫度、pH及顯示DO值?？刂茀?shù)的輸入是通過參數(shù)輸入及顯示裝置進(jìn)行的。

⑧當(dāng)發(fā)酵罐的溫度達(dá)到28～30℃時(shí)，進(jìn)行接種。

將酒精置接種口環(huán)內(nèi)，點(diǎn)燃，進(jìn)行無菌接種，接入種子。密封接種口。接種后立即進(jìn)行第一次取樣。

⑨在攪拌轉(zhuǎn)速300r/min和空氣流量在7mL/min下校正DO至100%。

（3）發(fā)酵過程各指標(biāo)的測定

發(fā)酵12h后，進(jìn)行第二次取樣。此后，每隔6h進(jìn)行一次取樣。

每次取樣檢測的指標(biāo)有生物量、還原糖、蛋白酶酶活、氨基態(tài)氮。

每2h采樣，作固定片結(jié)晶紫染色，鏡檢，觀察是否染菌。早期染菌則提前放罐。

（4）放罐

經(jīng)過發(fā)酵48h后，發(fā)酵液基本澄清，菌量增長緩慢，便可放罐。發(fā)酵液經(jīng)離心后，收集發(fā)酵液作進(jìn)一步處理。

（5）清洗

①放罐后，向發(fā)酵罐內(nèi)加入2500mL水。

②把取樣管插入發(fā)酵罐內(nèi)，固定。連同其他接觸過微生物的容器和物品，置高壓蒸汽滅菌鍋中滅菌。

③滅菌后清洗干凈，按要求存放。

（六）實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

1.畫出培養(yǎng)液中菌體生物量（g/L）隨流加培養(yǎng)時(shí)間變化的曲線。

2.菌絲體平菇多糖的含量的測定。

附：發(fā)酵罐操作流程

1.發(fā)酵準(zhǔn)備工作與設(shè)備檢查

檢查罐體安裝是否正確，罐蓋各配件裝置就位是否正確，密封是否良好，接口有否松動(dòng)等，發(fā)酵前需做保壓試驗(yàn)。

管閥系統(tǒng)需檢查閥門開閉狀態(tài)是否正確，避免接口有松動(dòng)、泄露現(xiàn)象。

電氣控制系統(tǒng)需檢查各電極、傳感器的連接是否正確，在進(jìn)入運(yùn)行前需先調(diào)好各測量參數(shù)、數(shù)據(jù)顯示等才能打開電源開關(guān)。

觀察空壓機(jī)的工作壓力、壓力繼電器、調(diào)壓過濾器是否正常，蒸汽發(fā)生的水、電、安全閥、進(jìn)出器閥以及接口是否正常。

2.滅菌

準(zhǔn)備工作：將排水硅膠軟管裝在排水排氣口上，打開排水排氣閥，關(guān)閉溢水閥和罐體上其他閥門，取出pH、DO電極校驗(yàn)，拔下泡沫電極、攪拌軸、頂蓋接地線的連接插頭，取出測溫電極等，擰下冷凝器進(jìn)出口接頭，補(bǔ)料瓶上安裝呼吸過濾器，擰下回水管堵頭，打開蒸汽發(fā)生器提供蒸汽。

（1）空罐滅菌

裝上pH、DO電極孔、三針補(bǔ)料口的堵頭。

安裝密封固定架，將進(jìn)氣口、取樣口、補(bǔ)料口膠管用專用夾夾緊，尾氣過濾瓶裝上，并敞開尾氣口。

打開控制面板，選擇滅菌輔助程序，設(shè)置參數(shù)。

提供蒸汽源，打開進(jìn)蒸汽閥，打開排水排氣閥，使升溫滅菌。

滅菌時(shí)間到，關(guān)閉進(jìn)蒸汽閥和蒸汽源。可適當(dāng)開大排水排氣閥。等罐壓降至常壓，全開排水排氣閥，放盡冷凝水，取下滅菌罩，滅菌完畢。

（2）實(shí)罐滅菌

空罐滅菌后，應(yīng)盡快進(jìn)行實(shí)罐滅菌。

裝上校正好的pH、DO電極并旋上保護(hù)蓋，按工藝要求放入培養(yǎng)液。其他操作同上述“空罐滅菌”。

3.開機(jī)和培養(yǎng)

（1）開機(jī)運(yùn)行準(zhǔn)備工作

安裝回水管堵頭，關(guān)閉排水排氣閥，打開溢流水閥和冷卻水源。打開空壓機(jī)，將壓力調(diào)整為0.1～0.15MPa。進(jìn)氣過濾器與壓力表連接。打開氣路調(diào)節(jié)閥，松開進(jìn)氣、尾氣口膠管夾頭，調(diào)節(jié)氣量至所需流量。安裝好攪拌電機(jī)和頂蓋接地線。插上測溫電極，取下pH、DO電極保護(hù)蓋，并連接。將補(bǔ)料瓶的輸液膠管安裝在對(duì)應(yīng)蠕動(dòng)泵上，松開補(bǔ)料口夾頭。在非運(yùn)行狀態(tài)下，打開總電源開關(guān)，設(shè)置較低的溫度，進(jìn)入RUN，使罐溫迅速下降。

（2）控制參數(shù)設(shè)置與運(yùn)行

按工藝要求設(shè)置攪拌轉(zhuǎn)速、培養(yǎng)溫度、pH、DO參數(shù)、消泡加液量以及相應(yīng)的報(bào)警上、下參數(shù)。在1h內(nèi)先進(jìn)行低速運(yùn)轉(zhuǎn)（100轉(zhuǎn)以下），等頂蓋溫度降至常溫時(shí)再設(shè)置到要求的速度。投入運(yùn)行，觀察各控制參數(shù)顯示情況是否正常。按工藝要求調(diào)整罐壓與空氣流量。

（3）接種培養(yǎng)

當(dāng)各測量參數(shù)顯示正常穩(wěn)定時(shí)，就可進(jìn)行接種（接種時(shí)應(yīng)確保實(shí)驗(yàn)室空氣相對(duì)靜止，如關(guān)掉電扇等）。

點(diǎn)燃酒精盤內(nèi)無水酒精或酒精棉，適當(dāng)加大通氣量或減小尾氣流量，接種合格的搖床菌種。接種完畢按工藝要求恢復(fù)罐壓和通氣量。

（4）取樣與放料

夾緊尾氣膠管（使罐內(nèi)適當(dāng)增壓，但罐壓不得大于0.1MPa）。

把無菌取樣瓶置于酒精焰上，拔去瓶塞，對(duì)準(zhǔn)取料口，調(diào)節(jié)點(diǎn)壓板，從取料膠管取出所需樣品后再夾緊點(diǎn)夾子，蓋上取樣瓶蓋，夾緊取樣管口的膠管。

放去膠管內(nèi)的殘料。

取樣前后應(yīng)用75%酒精對(duì)取料口消毒。

放料方法與取料方法同。

4.發(fā)酵罐的清潔保養(yǎng)方法

（1）清洗

清洗前應(yīng)取出pH、DO電極，按要求進(jìn)行保養(yǎng)。

清洗罐內(nèi)可配合進(jìn)水進(jìn)氣、電機(jī)攪拌、加溫一起進(jìn)行，如多次換水還不能清洗潔凈，則要打開頂蓋用軟毛刷刷洗罐內(nèi)部件。方法如下：

關(guān)閉控制開關(guān)與電源開關(guān)，取下頂蓋電極、電機(jī)及其連線插頭，擰下進(jìn)氣膠管、冷凝器接頭。

擰松罐蓋緊固螺絲，小心、垂直向上取出罐蓋，橫置于平整桌面，墊好，不要碰撞，刷洗干凈罐內(nèi)部件。

玻璃罐取出，小心清洗干凈，輕輕放回原位，注意四周間隙對(duì)稱。

清洗后安裝要注意罐內(nèi)密封圈、硅膠墊就位情況。

擰緊罐蓋四個(gè)緊固螺絲，用力均勻平衡，并注意罐與罐座間隙均衡，螺絲不要擰得過緊以免損壞玻璃罐。

（2）試車

將電極、電機(jī)、電纜、進(jìn)氣膠管安裝就位。

安裝完畢后要對(duì)罐體內(nèi)通氣作密封性試驗(yàn)。

對(duì)系統(tǒng)進(jìn)行2～3h試運(yùn)行，一切情況正常方可使用。

（3）發(fā)酵罐待用

如果短期內(nèi)需再次培養(yǎng)發(fā)酵，應(yīng)對(duì)其進(jìn)行滅菌后通入無菌空氣，保壓待用。

如準(zhǔn)備長期停用，需放去水箱與罐內(nèi)存水，放松罐蓋緊固螺絲，取出電極保養(yǎng)儲(chǔ)存好，關(guān)閉電源及所有閥門，蓋上防塵罩。

每次培養(yǎng)后應(yīng)用干凈抹布清除罐體上的臟物、水漬。

5.檢查維護(hù)

為了保證設(shè)備的正常運(yùn)行，除了熟悉設(shè)備的工作原理與各部件的結(jié)構(gòu)、功能作用外，還應(yīng)該加強(qiáng)設(shè)備的維護(hù)與管理，只有做到精心維護(hù)才能保證設(shè)備處于最好狀態(tài)，延長設(shè)備的使用年限。

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（編者：高永生）