真核生物基因轉(zhuǎn)錄的直接產(chǎn)物一般是無功能的，稱為初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（primary transcripts），需在細胞核內(nèi)進行加工修飾，成為成熟的RNA，具有活性，才能發(fā)揮各自的功能。真核生物的轉(zhuǎn)錄后加工修飾遠比原核生物復(fù)雜，不同RNA的加工方式不同。

（一）mRNA前體的轉(zhuǎn)錄后加工

真核生物mRNA的初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物是hnRNA，稱為雜化核RNA（hetero-nuclear RNA，hnRNA），mRNA的加工包括5′端加帽、3′端加poly（A）尾、剪接（splicing）以及編輯（eduting）等。

1．5′端帽子結(jié)構(gòu)的形成（圖5-4） mRNA前體的5′端為pppNp-，RNA鏈開始合成后不久，經(jīng)磷酸酶催化水解，釋放出Pi，5′端成為ppNp-；在鳥苷酸轉(zhuǎn)移酶催化下，與一分子三磷酸鳥苷酸反應(yīng)，末端成為GpppNp-，加上去的鳥苷酸與原5′末端的核苷酸不是以3′，5′-磷酸二酯鍵連接，而是通過5′磷酸基團相連，因此，加帽后的5′端仍具有3′-OH和2′-OH。mRNA前體的5′端加上鳥苷酸后，在甲基轉(zhuǎn)移酶催化下，由S-腺苷甲硫氨酸（SAM）供給甲基，在鳥嘌呤的N-7上甲基化，成為m7 GpppNp-，這就是mRNA5′末端的帽子結(jié)構(gòu)，稱為帽子0型結(jié)構(gòu)。

圖5-4　真核細胞mRNA的加帽反應(yīng)

連于鳥苷酸的第一個或第二個核苷酸的2′-OH也可以被甲基化，連于鳥苷酸的第一個核苷酸2′-OH被甲基化，稱為Ⅰ型帽子結(jié)構(gòu)，若第一個核苷酸和第二個核苷酸的2′-OH都被甲基化，則稱為Ⅱ型帽子結(jié)構(gòu)。

2．3′端多聚腺苷酸的加入（圖5-5） mRNA3′端的多聚腺苷酸（poly A）尾巴是轉(zhuǎn)錄后加上去的，在模板鏈上沒有相應(yīng)的polyT序列。mRNA3′端加poly（A）尾的反應(yīng)是在細胞核內(nèi)完成的。在結(jié)構(gòu)基因最后一個外顯子的3′端，常有一組共同序列AATAAA，其下游還有相當(dāng)多的GT序列，這些序列稱為轉(zhuǎn)錄終止的修飾點。當(dāng)轉(zhuǎn)錄中的mRNA前體出現(xiàn)加尾信號（AAUAAA及其下游的GU豐富區(qū)或U豐富區(qū)）時，即可被幾個蛋白因子識別并結(jié)合。

哺乳動物mRNA在加尾信號部位的斷裂需要幾個蛋白質(zhì)的作用。

（1）斷裂與多聚腺苷酸化特異性因子（cleavage and polyadenylation specificity factor，CPSF），為加poly（A）尾所必需的蛋白，CPSF的作用是識別并結(jié)合AAUAAA信號。

（2）斷裂刺激因子（cleavage stimulation factor，CstF），也參加識別多聚腺苷酸化位點，CstF結(jié)合于GU豐富區(qū)。CPSF和CstF結(jié)合于mRNA的斷裂和多聚腺苷酸化位點的兩側(cè)，兩個因子單獨與mRNA結(jié)合都是不穩(wěn)定的，同時結(jié)合則可協(xié)同作用，形成穩(wěn)定的復(fù)合物。

圖5-5　真核細胞mRNA加尾反應(yīng)模式

（3）斷裂因子Ⅰ和Ⅱ（cleavage factorⅠ，CFⅠ和cleavage factorⅡ，CFⅡ），為特殊的內(nèi)切核酸酶，負責(zé)剪切反應(yīng)。

（4）poly（A）聚合酶也可能參與mRNA斷裂過程，因為mRNA一斷裂，加A的反應(yīng)就立即開始，沒有時間間隔。

當(dāng)上述幾種因子結(jié)合于mRNA后，即可在AAUAAA下游10～30個核苷酸處將mRNA切斷，poly（A）聚合酶隨即以ATP為底物，在mRNA的3′末端催化合成poly（A）。加A過程分為兩個階段，第一階段是起始階段，在mRNA3′端緩慢加上至少10個A，此階段依賴于AAUAAA和CPSF；第二階段是延長階段，不依賴AAUAAA，而是依賴于第一階段加的oligo（A），當(dāng)oligo（A）形成后，poly（A）-結(jié)合蛋白Ⅱ［poly（A）-binding proteinⅡ，PABPⅡ］與之結(jié)合，促進poly（A）聚合酶的加A反應(yīng)，第二階段的反應(yīng)很快，在mRNA的3′末端加上200多個A。

一般真核生物在胞質(zhì)中出現(xiàn)的mRNA的poly（A）長度在100～200個核苷酸之間。也有少數(shù)例外，如組蛋白基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，無論是初級的或成熟的都沒有poly（A）尾。

3．mRNA前體的剪接 1977年，Philip Sharp和Richard Roberts在研究腺病毒基因時發(fā)現(xiàn)表達蛋白質(zhì)出現(xiàn)斷裂現(xiàn)象，即基因中間被一些不能表達蛋白質(zhì)的核苷酸所隔開，致使一個結(jié)構(gòu)基因被斷裂為若干部分。進一步研究表明，基因斷裂是真核細胞及其病毒基因組中的普遍現(xiàn)象，這種不連續(xù)的被若干序列區(qū)域分隔開的結(jié)構(gòu)基因稱為斷裂基因。斷裂基因由外顯子（exon）和內(nèi)含子（intron）兩部分組成，分別表示基因的編碼序列和非編碼序列，在轉(zhuǎn)錄過程中內(nèi)含子和外顯子一同被轉(zhuǎn)錄，形成初級RNA，初級RNA需要經(jīng)過剪接加工，以除去內(nèi)含子序列，并將相關(guān)的外顯子序列連接成為成熟的有功能的mRNA分子。

不同的斷裂基因所含有的內(nèi)含子數(shù)目不一定相同，內(nèi)含子的大小也變化不定。一般來說，內(nèi)含子的數(shù)量和長度都非常大，初始轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物會很長，轉(zhuǎn)錄后加工時必須剪切除去。以雞卵清蛋白為例，其基因長達7．7×103nt，有6個內(nèi)含子，經(jīng)過剪接后，成熟的mRNA只有1 872nt（圖5-6）。

圖5-6　雞卵清蛋白基因結(jié)構(gòu)及其mRNA的后加工

mRNA前體的剪接是高度精確的，一方面取決于外顯子和內(nèi)含子交界處的剪接信號，另一方面取決于5種被稱為snRNA的核糖核酸蛋白質(zhì)復(fù)合物。

（1）mRNA前體中內(nèi)含子的剪接位點：通過比較多種蛋白質(zhì)基因剪接位點周圍的核苷酸序列發(fā)現(xiàn)，內(nèi)含子具有相同的開始和結(jié)尾，即總是由GU開始，以AG結(jié)尾，此規(guī)律稱為“GUAG”規(guī)律。內(nèi)含子含有3個保守序列：內(nèi)含子的5′-端剪接點由GUAAGU組成；3′-端剪接點由（Py）nNPyAG組成，n大約為10，N為任意堿基，Py指嘧啶；3′-端上游18～40個核苷酸處也有一個保守序列，稱為分支點（branch site），在酵母細胞是由UACUAAC組成，保守性極強，哺乳動物分支點序列保守性較差。

（2）snRNA：真核細胞的細胞核內(nèi)含有許多高度保守的小分子RNA（一般≤300堿基），這些RNA統(tǒng)稱為snRNA（small nuclear RNA）。在mRNA剪接過程中至少有5種snRNA，包括U1、U2、U4、U5和U6snRNA。這些snRNA分別與特異蛋白質(zhì)結(jié)合成細胞核小分子核糖核蛋白顆粒（snRNP），參與mRNA前體的剪接過程。除了snRNA之外，參與剪接作用的還有若干非snRNA的剪接因子，如SR蛋白（其C端結(jié)構(gòu)域富含Ser和Arg的區(qū)域）。snRNA與剪接因子結(jié)合構(gòu)成剪接體。剪接體是mRNA前體在剪接過程中由snRNA和蛋白質(zhì)組裝形成的具有催化剪接反應(yīng)的多組分復(fù)合物。

（3）剪接體的組裝及剪接過程：剪接體是剪接反應(yīng)的場所，它的組裝是一個有序、耗能的過程，而其本身也處在動態(tài)變化之中。剪接體的組裝、發(fā)揮剪接作用和解體稱為剪接體循環(huán)（spliceosome cycle）。通過控制剪接體的組裝，細胞可以調(diào)節(jié)剪接的質(zhì)量和數(shù)量，從而調(diào)節(jié)基因表達：①組裝是從U1與剪接底物（RNA）開始，U1snRNP識別并結(jié)合于內(nèi)含子的5′端剪接點（GU及其鄰近序列）。②U2snRNP識別并結(jié)合于分支點（此過程需要ATP）。③U4／U6和U5snRNP加入。④U4隨后與U6解離，使U2和U6能夠通過堿基配對而結(jié)合，至此，剪接體全部組裝完畢。此時U2和U6snRNP形成催化中心，催化磷酸酯鍵轉(zhuǎn)移反應(yīng)。在剪接體上進行的剪接作用，既無水解反應(yīng)，又無磷酸二酯鍵數(shù)目的改變，剪接反應(yīng)實際上是轉(zhuǎn)酯反應(yīng)。⑤通過水解ATP提供能量，完成第一步轉(zhuǎn)酯反應(yīng)。內(nèi)含子分支點中A的2′-OH與內(nèi)含子5′端G的5′-磷酸基團通過轉(zhuǎn)酯反應(yīng)而結(jié)合，形成2′，5′-磷酸二酯鍵，內(nèi)含子自身成環(huán)，形成套索結(jié)構(gòu)，稱套索（lariat）RNA結(jié)構(gòu)。⑥第二次轉(zhuǎn)酯反應(yīng)亦需要水解ATP提供能量，內(nèi)含子上游外顯子的3′-OH與下游外顯子第一個核苷酸的5′-磷酸基團通過轉(zhuǎn)酯反應(yīng)而結(jié)合，形成3′，5′-磷酸二酯鍵，兩個外顯子即以磷酸二酯鍵相連。⑦剪接反應(yīng)完成后，剪接體所有成分解體，可被再用于形成其他的剪接中間體（圖5-7）。

圖5-7　mRNA的剪接

4．RNA的編輯（RNA editing） 這是RNA轉(zhuǎn)錄后改變mRNA序列的一種加工修飾方式。有一些基因的mRNA在轉(zhuǎn)錄后因插入、缺失或替換一些核苷酸而改變了模板DNA來源的遺傳信息，從而翻譯出許多氨基酸序列不同的蛋白質(zhì)。

1896年，Benne R所研究的原生動物鞭毛蟲的錐體蟲線粒體mRNA的編輯加工是目前研究得較詳細的一個例子。線粒體細胞色素氧化酶亞基Ⅱ的成熟mRNA的編碼區(qū)序列比其基因的編碼鏈多出4個U（圖5-8），在排除其他因素后，發(fā)現(xiàn)這4個U是在轉(zhuǎn)錄后添加進去的。

圖5-8　錐體蟲線粒體細胞色素氧化酶亞基Ⅱ的mRNA序列與其基因編碼鏈序列的比較

RNA編輯的方式主要有兩種：一種是在編碼區(qū)增減一定數(shù)目的核苷酸，如絨泡菌線粒體中發(fā)現(xiàn)胞苷酸殘基（C）的插入編輯，皰疹病毒mRNA中發(fā)現(xiàn)鳥苷酸殘基的插入編輯。另一種是編碼區(qū)的堿基發(fā)生轉(zhuǎn)換或顛換，如載脂蛋白B mRNA中發(fā)現(xiàn)C→U取代編輯。介導(dǎo)RNA編輯的機制也有兩種：依賴于指導(dǎo)RNA（guide RNA，gRNA）的編輯和依賴于特定的核苷酸脫氨酶的編輯。RNA編輯的生物學(xué)意義在于RNA編輯增加轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的多樣性，擴大遺傳信息；補救某種基因突變，恢復(fù)突變中丟失的遺傳信息，改變和補充遺傳信息的功能；賦予轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物新的序列，有利于生物進化。

（二）tRNA前體的轉(zhuǎn)錄后加工

真核生物多數(shù)tRNA前體分子含有內(nèi)含子，也需通過剪接作用才能變成成熟tRNA。tRNA前體的轉(zhuǎn)錄后加工方式有：剪接去除內(nèi)含子、剪切5′端先導(dǎo)序列、添加或修復(fù)3′端CCA以及堿基的化學(xué)修飾等。

1．tRNA前體的剪接 tRNA前體的剪接作用是在兩種不同酶的作用下完成的，先由內(nèi)切核酸酶催化進行剪切反應(yīng)，再由連接酶將外顯子連接起來。如酵母酪氨酸t(yī)RNA前體有一個14核苷酸的內(nèi)含子，位于反密碼子3′側(cè)，其剪接作用即分兩步進行。先由一種與膜結(jié)合的內(nèi)切核酸酶把內(nèi)含子從tRNA前體上切下，使tRNA前體分成5′端半分子和3′端半分子，然后由ATP提供能量，RNA連接酶把兩個半分子連接成為成熟的tRNA（圖5-9）。

圖5-9　酵母酪氨酸t(yī)RNA的加工

2．切除5′端先導(dǎo)序列 除了剪接反應(yīng)外，真核細胞tRNA前體也存在剪切加工。如酵母酪氨酸t(yī)RNA前體5′端有一段由16nt組成的核苷酸序列，稱為先導(dǎo)序列（leader sequence）。該序列是由內(nèi)切核酸酶RNase P水解切除的。

3．添加或修復(fù)3′端CCA序列 真核細胞tRNA前體在tRNA核苷酸轉(zhuǎn)移酶催化下，將3′端除去兩個U，由CTP、ATP提供C和A，加上CCA序列，形成氨基酸的結(jié)合位點。

4．化學(xué)修飾 真核生物tRNA前體的加工也存在著化學(xué)修飾反應(yīng)，如甲基化反應(yīng)：由tRNA甲基轉(zhuǎn)移酶催化某些嘌呤生成甲基嘌呤；還原反應(yīng)：通過還原反應(yīng)使某些尿嘧啶還原為雙氫尿嘧啶（DHU）；核苷內(nèi)轉(zhuǎn)位反應(yīng)：通過核苷內(nèi)的轉(zhuǎn)位反應(yīng)使尿嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)榧倌蜞奏ず塑眨é祝?；脫氨基反?yīng)：在脫氨酶催化下腺苷酸脫氨基成為次黃嘌呤核苷酸（I）等。

（三）rRNA前體的轉(zhuǎn)錄后加工

rRNA前體的加工主要是前體的剪接和化學(xué)修飾。

1．rRNA前體的剪接 在哺乳動物基因組中，28S、18S和5．8SrRNA基因串聯(lián)在一起形成一個轉(zhuǎn)錄單位，在基因組中重復(fù)幾百次，即每個基因有幾百個拷貝。每個轉(zhuǎn)錄單位之間的間隔DNA序列稱為非轉(zhuǎn)錄間隔序列（nontranscribed spacers），而一個重復(fù)單位內(nèi)的3個基因之間的間隔序列則是與基因一起轉(zhuǎn)錄的，稱為轉(zhuǎn)錄的間隔序列（transcribed spacers），這些序列在轉(zhuǎn)錄后加工過程中被切除。哺乳動物的RNA聚合酶Ⅰ轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物是45S的rRNA前體，其中含有28S、18S和5．8SrRNA。rRNA前體的剪接是通過“自我剪接”（self-splicing）機制進行的，此過程需要一種核仁小RNA（small nucleolar RNA，snoRNA），snoRNA參與rRNA前體的加工，并指導(dǎo)核糖和堿基的修飾。剪接過程的第一步是剪掉5′末端序列，形成41S的中間體；隨后將41SRNA裂解成32S（含有28S和5．8SrRNA）和20S（含有18SrRNA）兩段；最后，32SRNA經(jīng)裂解和修剪，產(chǎn)生28S和5．8SrRNA（可互補結(jié)合），20SRNA經(jīng)修剪后產(chǎn)生18SrRNA。

2．化學(xué)修飾 rRNA前體加工的另一種重要形式是化學(xué)修飾，主要是甲基化反應(yīng)。甲基化主要發(fā)生在核糖的2′-OH，甲基化可能是作為rRNA前體剪接加工的信號。此外，rRNA前體中的一些尿嘧啶核苷酸通過異構(gòu)作用可轉(zhuǎn)變?yōu)榧倌蜞奏ぁ?SrRNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物無需加工，與28SrRNA、5．8SrRNA以及多種蛋白質(zhì)分子一起組裝成為核糖體大亞基后，再轉(zhuǎn)移到胞質(zhì)。