小非編碼RNA由20～30個核苷酸（nt）構(gòu)成，已被公認(rèn)為是真核基因組表達(dá)和功能的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。根據(jù)小ncRNA分子的起源、結(jié)構(gòu)、所結(jié)合的效應(yīng)子蛋白以及功能作用，可以分為三類：短鏈干擾RNA（short interfering RNA，siRNA）、微小RNA（microRNA，miRNA）和piwi互作RNA（piwi-interacting RNA，piRNA）。

siRNA來源于完全互補(bǔ)的長的雙鏈RNA分子，經(jīng)核酸內(nèi)切酶Dicer加工而成。其作用主要針對外源或入侵的核酸起作用，如病毒、轉(zhuǎn)座子和轉(zhuǎn)基因等，常表現(xiàn)為維護(hù)基因組完整性的防衛(wèi)者。也有報告稱某些siRNA能在哺乳動物細(xì)胞中介導(dǎo)DNA甲基化和組蛋白修飾，進(jìn)而導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄基因沉默（transcriptionalgene silencing，TGS）。與siRNA不同，miRNA起源于不完全互補(bǔ)的發(fā)夾狀雙鏈RNA分子，也要經(jīng)核酸內(nèi)切酶Dicer或Drosha加工后成為內(nèi)源性基因的調(diào)節(jié)因子。siRNA和miRNA要通過和阿格諾蛋白（Argonaute protein）家族成員AGO 1或AGO2結(jié)合來發(fā)揮表觀遺傳調(diào)控作用。阿格諾蛋白是RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體（RNA-induced silencing complex，RISC）的催化組分，小RNA分子通過序列互補(bǔ)將具有核酸內(nèi)切酶活性的阿格諾蛋白導(dǎo)向特異性靶標(biāo)，導(dǎo)致與該小RNA互補(bǔ)的mRNA降解。piRNA主要在動物生殖細(xì)胞發(fā)育過程中靶向逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子。piRNA與siRNA和miRNA有兩點不同：一是piRNA的前體不是雙鏈而是單鏈RNA分子；二是piRNA結(jié)合的是與阿格諾蛋白家族進(jìn)化上有同源的Piwi蛋白成員，如MILI與MIWI2等。

1993年，美國發(fā)育生物學(xué)家安布羅斯（V.Ambros）等在秀麗線蟲（Caenorhabditis elegans）中首次發(fā)現(xiàn)了第一個具有內(nèi)源性調(diào)控作用的單鏈小非編碼RNA分子lin-4，其功能是通過抑制發(fā)育時程基因LIN-14來控制幼蟲正常發(fā)育。5年后，梅洛（C.C.Mello）和法艾爾（A.Z.Fire）等報道了外源性雙鏈RNA（dsRNA）可通過RNA干擾（RNAi）機(jī)制特異性地沉默基因。1999年，在植物中發(fā)現(xiàn)基因的沉默伴隨著20～25 nt RNA的出現(xiàn)。此后進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，dsRNA可以直接轉(zhuǎn)換成20～23 nt siRNA。

Dicer是dsRNA特異的RNaseⅢ家族核酶。內(nèi)源或外源雙鏈RNA前體分子在細(xì)胞內(nèi)可被Dicer加工成典型的長度約為21 nt的雙鏈分子。然后這個雙鏈產(chǎn)物經(jīng)過解旋，其中一條鏈作為指導(dǎo)鏈與AGO效應(yīng)子蛋白穩(wěn)定結(jié)合，形成不同種類的RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體RISC，另一條鏈（過客鏈）則被丟失。根據(jù)沃森-克里克堿基配對原理，指導(dǎo)鏈識別靶向RNA分子，主要通過堿基互補(bǔ)配對來抑制靶mRNA的翻譯或誘導(dǎo)其降解，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄基因沉默。最終，RISC可以分別通過抑制轉(zhuǎn)錄或翻譯、促進(jìn)異染色質(zhì)形成，以及加速RNA或DNA降解等機(jī)制，從而實現(xiàn)對各種靶基因的表達(dá)調(diào)控（圖5-4）。

迄今已知，大約30%的人基因表達(dá)受到miRNA的調(diào)節(jié)。miRNA可以通過直接靶向DNA、RNA或與組蛋白修飾酶等表觀遺傳機(jī)器而實現(xiàn)調(diào)節(jié)作用。最早發(fā)現(xiàn)miRNA對基因表達(dá)有調(diào)控作用的實驗研究往往涉及惡性腫瘤的發(fā)生與發(fā)展，這里就以肺癌和前列腺癌細(xì)胞為例來簡要說明miRNA對基因表達(dá)的調(diào)控作用。例如，最初在肺癌細(xì)胞株中發(fā)現(xiàn)，一個包括miR-29a、miR-29b和miR-29c的miRNA家族（miR-29s）可以直接調(diào)節(jié)DMNT3a和DMNT3b。miR-29表達(dá)可破壞從頭DNA甲基化，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的DNA普遍低甲基化。而在肺癌細(xì)胞中，由于腫瘤抑制基因（tumor suppressorgene，TSG）啟動子超甲基化，是被表觀沉默的。miR-29可使TSG啟動子的CpG島去甲基化使其重新表達(dá)，從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡和生長抑制。這些發(fā)現(xiàn)揭示，miRNA可以通過調(diào)節(jié)表觀遺傳過程來調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。在急性髓系白血病細(xì)胞中，miR-29b除了直接作用于DMNT3a和DMNT3b外，還可以通過對DNMTl基因的轉(zhuǎn)錄激活子SP1的調(diào)控而間接沉默該基因。此外，miR-148a和miR-14b也參與調(diào)控DNMT3b的表達(dá)，通過結(jié)合到DNMT3b基因mRNA編碼區(qū)域的一個特異位點，miR-148家族可以調(diào)節(jié)這個從頭開始合成的DNMT，并與DNMT3b的幾個不同剪切變異子的生成有密切關(guān)聯(lián)。另一方面，由于miR-148a本身也受表觀遺傳的調(diào)控，其啟動子在不同的腫瘤組織中表現(xiàn)為超甲基化狀態(tài)。這些證據(jù)說明，作為靶向表觀遺傳機(jī)器的miRNA還存在著自我擴(kuò)增的表觀遺傳環(huán)路。

圖5-4　siRNA和miRNA的來源及功能途徑

RAN-GTP是結(jié)合了GTP的Ras相關(guān)蛋白，GW182是一種支架蛋白。

miRNA也調(diào)節(jié)HDAC以及在表觀遺傳調(diào)控中起重要作用的多梳抑制復(fù)合物（polycomb repressive complex，PRC）基因的表達(dá)。HADC4是miR-1和miR-140調(diào)節(jié)的直接靶點，而miR-449a可與HDAC 1的3′-UTR區(qū)域結(jié)合。HADC 1在幾類腫瘤細(xì)胞中被上調(diào)，miR-449a在前列腺癌細(xì)胞中重新表達(dá)，可使HDAC 1水平降低，誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯、細(xì)胞凋亡以及衰老表型。多梳抑制復(fù)合物PRC2的催化亞基EZH2是組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶，可通過使組蛋白H3第27位氨基酸殘基賴氨酸三甲基化（H3K27me3）促使異染色質(zhì)形成，導(dǎo)致多個腫瘤抑制基因的沉默。在前列腺癌細(xì)胞株和原發(fā)腫瘤組織中，miR-101在腫瘤發(fā)展中表達(dá)下調(diào)，與EZH2的增加存在負(fù)相關(guān)。進(jìn)一步證據(jù)表明miR-101的確可以在前列腺和膀胱癌模型中直接靶向EZH2。miR-101介導(dǎo)的EZH2抑制阻止了腫瘤細(xì)胞的增殖和克隆形成。也揭示miR-101通過對腫瘤表觀基因組的調(diào)節(jié)而具有某種類似腫瘤抑制基因的作用。miRNA對表觀遺傳的調(diào)節(jié)存在細(xì)胞或物種特異性。例如，在小鼠胚胎干細(xì)胞中，miR-290簇直接作用于DNMT3基因的抑制子RBL2。在Dicer缺失的胚胎干細(xì)胞中，miR-290簇不表達(dá)，而RBL2卻過表達(dá)，從而導(dǎo)致染色體端粒重組和端粒的異常延長。若miR-290簇重新表達(dá)，則可以逆轉(zhuǎn)這種現(xiàn)象。然而，在Dicer功能被抑制的人胚腎細(xì)胞HEK293中，miR-290簇缺乏對從頭DNMT的調(diào)節(jié)作用。最近發(fā)現(xiàn)miR-155還可作為炎癥信號和腫瘤細(xì)胞能量代謝之間的橋梁，從一個側(cè)面提示慢性炎癥和感染是腫瘤發(fā)生的一個重要誘因，約有1/4的腫瘤發(fā)生與炎癥相關(guān)。

siRNA通過誘導(dǎo)異染色質(zhì)的形成，也可以實現(xiàn)對基因表達(dá)的調(diào)控。對單細(xì)胞真核生物，如紅色鏈孢霉（Neurospora crassa）的研究表明，編碼H3 Lys9甲基轉(zhuǎn)移酶的基因是DNA甲基化所必需的，即DNA甲基化修飾過程是接受來自染色質(zhì)的指令的。實驗進(jìn)一步表明組蛋白的修飾又會受到RNA干擾（RNA interference，RNAi）的指令。在裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）中，含AGO1的效應(yīng)子構(gòu)成了RNA誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄沉默（RNA-induced transcription silencing，RITS）復(fù)合物，通過結(jié)合的siRNA可被導(dǎo)向特異的染色體位點，例如，著絲粒重復(fù)序列。RITS復(fù)合物與RNA多聚酶Ⅱ的直接相互作用可加速新生轉(zhuǎn)錄物對siRNA的識別。在組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶（HMT）介導(dǎo)下，RITS復(fù)合物的結(jié)合可促進(jìn)組蛋白H3第9位氨基酸殘基賴氨酸（H3K9）的甲基化，進(jìn)而誘導(dǎo)募集具有染色質(zhì)結(jié)構(gòu)域的Swi6蛋白（HP1在酵母中的同源蛋白），最終導(dǎo)致染色質(zhì)濃縮。RITS對新生轉(zhuǎn)錄物結(jié)合也可激活RNA依賴的RNA聚合酶復(fù)合物（RDRC），RDRC利用其RdRP亞基（Rdpl）產(chǎn)生次級siRNA，進(jìn)而加強(qiáng)和擴(kuò)散沉默效應(yīng)。

piRNA是在哺乳動物中發(fā)現(xiàn)的一種單鏈起源的長度為24～31 nt的小RNA分子，因能與Piwi蛋白偶聯(lián)，被稱為piRNA（piwi interacting RNA）。Piwi蛋白是阿格諾蛋白的一個亞家族，已知包括MIWI、MIWI2和MILI，也都是表觀遺傳調(diào)控因子。piRNA主要以限定模式在哺乳動物的生殖細(xì)胞中表達(dá)，其功能是在配子形成過程中沉默轉(zhuǎn)座子和重復(fù)序列等“自私性”遺傳元件、維持生殖細(xì)胞基因組的穩(wěn)定性和完整性。2008年，日本學(xué)者倉持宮川（S.Kuramochi-Miyagawa）等證實，缺失piRNA相互作用蛋白MIL1和MIWI2可導(dǎo)致雄性生殖細(xì)胞逆轉(zhuǎn)座子從頭DNA甲基化喪失。提示在哺乳動物生殖細(xì)胞中存在RNA指導(dǎo)的DNA甲基化機(jī)制，為基因表達(dá)的表觀遺傳調(diào)節(jié)通路提供了新的證據(jù)。近年來在非生殖器官中也發(fā)現(xiàn)了Piwi蛋白的高表達(dá)，暗示piRNA還可能存在更廣泛的調(diào)控作用。

三種具有表觀遺傳調(diào)控作用的小RNA分子的來源和行使功能途徑可見圖5-5。然而近年來一系列新的實驗提示，除了多種小RNA分子外，真核細(xì)胞中還存在一個由長鏈非編碼RNA分子廣泛參與調(diào)節(jié)，并與組蛋白結(jié)構(gòu)修飾和DNA甲基化系統(tǒng)組成的一個表觀遺傳修飾網(wǎng)絡(luò)，能動地調(diào)控著具有組織和細(xì)胞特異性的基因表達(dá)模式。機(jī)體的表觀遺傳模式的變化在整個發(fā)育過程中是高度有序并嚴(yán)格受控的。

圖5-5　三種小RNA的來源和表觀遺傳調(diào)控作用示意

（a）siRNA起源于長鏈RNA分子，經(jīng)Dicer酶剪切為21～25 nt的雙鏈RNA片段，Dicer酶和dsRNA結(jié)合蛋白將siRNA二聚體載入阿格諾蛋白（AGO2），然后沉默靶基因；（b）miRNA內(nèi)源基因產(chǎn)生長度為65～70 nt且含有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的miRNA前體，經(jīng)Drosha-DGCR8蛋白復(fù)合物加工產(chǎn)生miRNA前體，再經(jīng)Dicer酶剪切為miRNA-miRNA*二聚體，其中miRNA*為過客鏈，miRNA為指導(dǎo)鏈，指導(dǎo)鏈miRNA載入阿格諾蛋白AGO 1發(fā)揮沉默靶基因作用；（c）piRNA起源于單鏈RNA前體，產(chǎn)生的piRNA意義鏈在性腺發(fā)育早期傾向與MILI結(jié)合，而次級反義鏈更傾向與MIWI2結(jié)合，次級反義piRNA可能直接裂解轉(zhuǎn)座子的mRNA