實(shí)驗(yàn)十五　酶法測定血清中游離脂肪酸

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了解和掌握酶法測定血清中游離脂肪酸的原理和操作步驟。

【實(shí)驗(yàn)原理】

臨床上將C10以上的脂肪酸稱為游離脂肪酸(free fatty acid，F(xiàn)FA)或非酯化脂肪酸(nonesterifiedfatty acid，NFFA)，正常血清中含有油酸(18∶1)、軟脂酸(16∶0)和硬脂酸(18∶0)，另外還有少量的月桂酸(12∶0)、肉豆蔻酸(14∶0)和花生四烯酸(20∶4)等。與其他脂質(zhì)比較，NFFA在血中濃度很低，其含量水平易受脂代謝、糖代謝和內(nèi)分泌機(jī)能等因素的影響，血中NFFA半衰期為1～2分鐘。血清中的NFFA與清蛋白結(jié)合成一種簡單的脂蛋白進(jìn)行運(yùn)輸。

測定血清NFFA的方法有滴定法、比色法、原子分光光度法、高壓液相層析法和酶法等。一般多以酶法測定。制作NFFA測定的標(biāo)本時一定要注意在4℃條件下分離血清并盡快進(jìn)行測定。因?yàn)檠杏懈鞣N脂肪酶存在，極易快速使血中TG和PL酯型脂肪酸分解成非酯化的FFA，使血中NFFA值上升。儲存標(biāo)本僅限于24小時內(nèi)，若保存3天，其值約升高30%，導(dǎo)致結(jié)果不準(zhǔn)確。

酶法測定游離脂肪酸的原理:血清中游離脂肪酸或非酯化脂肪酸(NEFA)，經(jīng)酶試劑作用生成紫色化合物，其顏色深淺與NFFA含量成正比。

【實(shí)驗(yàn)材料】

人血清。

【實(shí)驗(yàn)器材】

試管、恒溫水浴鍋、高速冷凍離心機(jī)、分光光度計等。

【藥品試劑】

1．緩沖液:0．04 mmol/L pH6．9磷酸緩沖液，3 mol/L MgCl₂，0．15%去垢劑。

2．酶/輔酶:乙酰CoA合成酶≥0．3 U/ml，抗壞血酸氧化酶≥1．5 U/ml，CoA0．9 mmol/L，ATP 5 mmol/L，4-AAP1．5 mmol/L，溶于10 ml上述緩沖液中。冷藏5日內(nèi)使用。

3．酶稀釋液:苯氧乙醇0．3%(V/V)。

4．馬來酰亞胺混合液:馬來酰亞胺10．6 mmol/L，與酶稀釋液等體積混合。

5．酶試劑:乙酰CoA氧化酶≥10 U/ml，過氧化物酶7．5 U/ml，TOOS 0．2 mmol/L，混合上述試劑，再與等體積馬來酰亞胺混合液混合。冷藏5日內(nèi)使用。

6．1 mmol/L游離脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)液:冷藏。

【實(shí)驗(yàn)方法】

1．抽提:準(zhǔn)備四支試管，分別標(biāo)記為試劑空白管、標(biāo)準(zhǔn)管和測定管以及測定空白管。在試劑空白管中加入25μl水和0．5 ml酶/輔酶;在標(biāo)準(zhǔn)管中加入25μl 1 mmol/L游離脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)液和0．5 ml酶/輔酶;在測定管中加入25μl和0．5 ml酶/輔酶;在測定空白管中加入0．5ml酶/輔酶?；靹蚝笤?7℃水浴10分鐘。

2．顯色:分別向四支試管中加入1 ml酶試劑，同時在測定空白管中加入25μl血清，混勻后，在37℃水浴10分鐘。

3．測定:以空白管調(diào)節(jié)零點(diǎn)，在550nm波長下測定各管的吸收值，分別記錄為標(biāo)準(zhǔn)管(T)，測定管(A)和測定空白管(BT)。

4．計算:

【思考題】

簡述酶法測定血清中游離脂肪酸的原理。