血清肌酐測(cè)定_生物化學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)

肌酐(creatinine,Cr)是肌肉中磷酸肌酸代謝的終產(chǎn)物,由腎排出。它從腎小球?yàn)V過(guò)后不被腎小管重吸收,故每日尿肌酐的排泌量基本上等于其生成量,肌酐的排出量較恒定。因此,測(cè)定血及尿中肌酐的含量更能反映腎的排泄功能。

血清肌酐測(cè)定方法主要有堿性苦味酸(Jaffe法)、酶偶聯(lián)法、高效液相色譜法等。

(一)堿性苦味酸比色法

【原理】 血漿或血清樣本經(jīng)除蛋白處理后,肌酐與堿性苦味酸產(chǎn)生Jaffe反應(yīng),生成橙紅色的苦味酸肌酐復(fù)合物,在510nm處比色,在一定范圍內(nèi)吸光度與肌酐含量成正比。尿液樣本可稀釋后直接測(cè)定。

【器材與試劑】

1.器材 試管、試管架、離心機(jī)、離心管、刻度吸管、分光光度計(jì)。

2.試劑

(1)35mmol/L鎢酸溶液:①將1g聚乙烯醇溶解于100ml去離子水中,加熱助溶(不要煮沸),冷卻。②將11.1g鎢酸鈉溶于300ml去離子水中,使其完全溶解。③在300ml去離子水中緩慢加入2.1ml濃硫酸,冷卻,于1L容量瓶中,將①液加入②液中,再與③液混勻,加入去離子水至刻度,置室溫保存,可穩(wěn)定1年。

(2)40mmol/L苦味酸溶液:取9.3g苦味酸溶于500ml 80℃去離子水中,冷卻至室溫,加入去離子水至1L。用0.1mol/L NaOH滴定,以酚酞作指示劑。根據(jù)滴定結(jié)果,用去離子水稀釋至40mmol/L。儲(chǔ)存于棕色瓶中,室溫可保存半年。

(3)0.75mol/L氫氧化鈉溶液:取30g NaOH,加去離子水使其溶解,冷卻后定容至1L。

(4)10mmol/L肌酐標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)存液:取113mg肌酐,用0.1mol/L鹽酸溶解,并移入100ml容量瓶中,再用0.1mol/L鹽酸定容至刻度。冰箱保存,可穩(wěn)定1年。

(5)10μmol/L肌酐標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液:取1.0ml肌酐標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)存液于1L容量瓶中,用0.1mol/L鹽酸稀釋至刻度。冰箱保存可用2個(gè)月。

【操作】 準(zhǔn)確吸取0.5ml血清(或血漿),加入35mmol/L鎢酸溶液4.5ml,充分混勻, 3000r/min離心10min,取上清液即為無(wú)蛋白血濾液。按表10-3操作。

表10-3　堿性苦味酸比色法測(cè)定血清肌酐的操作步驟

【參考區(qū)間】 男性:44~133μmol/L;女性:70~106μmol/L。

【質(zhì)量保證】

1.反應(yīng)以15~25℃為宜。溫度升高可使堿性苦味酸顯色加深,測(cè)定管比標(biāo)準(zhǔn)管更明顯。

2.顯色后標(biāo)準(zhǔn)管色澤較穩(wěn)定,測(cè)定管吸光度隨時(shí)間延長(zhǎng)而增加,可能與血清中非特異性物質(zhì)(假性肌酐)與苦味酸發(fā)生反應(yīng)有關(guān),因此,加顯色劑后應(yīng)及時(shí)比色。

混勻,室溫置15min,用分光光度計(jì)在510nm處比色,以空白管調(diào)零,讀取各管吸光度。

【計(jì)算】

3.血清標(biāo)本于冰箱保存3d,-20℃保存較長(zhǎng)時(shí)間,輕微溶血對(duì)肌酐測(cè)定無(wú)影響。

4.尿肌酐測(cè)定,可用蒸餾水作1∶200稀釋,按同樣方法操作,結(jié)果乘以稀釋倍數(shù)。

【應(yīng)用評(píng)價(jià)】

1.特異性 特異性不高,易受蛋白質(zhì)、葡萄糖、丙酮、丙酮酸、維生素C等影響。

2.回收率 受無(wú)蛋白血濾液p H的影響,濾液p H在3.0~4.5時(shí),回收率為85%~ 90%;p H在2.0以下時(shí),回收率為100%。

3.線(xiàn)性范圍 上限可達(dá)1320μmol/L。

【臨床意義】

1.血肌酐主要經(jīng)腎小球?yàn)V過(guò),幾乎不被腎小管重吸收。腎小球?yàn)V過(guò)率下降至正常人的1/3時(shí),血肌酐才明顯上升,因此,肌酐測(cè)定是反映腎小球?yàn)V過(guò)率下降的后期指標(biāo),對(duì)腎病的早期診斷意義不大。

2.腎源性和非腎源性血肌酐增高程度不同,腎衰竭血清肌酐濃度常>200μmol/L,心力衰竭血肌酐濃度<200μmol/L。

(二)堿性苦味酸速率法

【原理】 在堿性環(huán)境中,肌酐與堿性苦味酸反應(yīng),生成橘紅色的苦味酸肌酐復(fù)合物,樣品中肌酐、干擾物與苦味酸的反應(yīng)速度不同,選擇合適的監(jiān)測(cè)時(shí)間,可排除干擾物的影響,提高肌酐測(cè)定的特異性。

【器材與試劑】

1.器材 試管、加樣器、恒溫水浴箱、分光光度計(jì)或自動(dòng)生化分析儀。

2.試劑

(1)40mmol/L苦味酸溶液:見(jiàn)堿性苦味酸比色法。

(2)0.32mol/L氫氧化鈉溶液:取12.8g氫氧化鈉,用蒸餾水溶解,冷卻后定容至1L。

(3)堿性苦味酸溶液:將(1)液和(2)液等體積混合,放置20min后使用。

(4)100μmol/L肌酐標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液:參見(jiàn)堿性苦味酸比色法。

【操作】 按表10-4操作。

表10-4　堿性苦味酸速率法測(cè)定血清肌酐的操作步驟

分析儀波長(zhǎng)510nm,比色杯光徑1.0cm,反應(yīng)溫度37℃(或25℃),樣品體積100μl,試劑體積1000μl。在試劑混合后,準(zhǔn)確反應(yīng)20s,讀取吸光度A 20標(biāo)和A 20測(cè);待反應(yīng)進(jìn)行至60s時(shí),讀取吸光度A 60標(biāo)和A60測(cè)。

【計(jì)算】

【參考區(qū)間】 男性:53~97μmol/L;女性:44~80μmol/L。

【應(yīng)用評(píng)價(jià)】

1.特異性 特異性不高,易受蛋白質(zhì)、葡萄糖、丙酮、丙酮酸、維生素C等的影響。

2.精密度 重復(fù)性較好,批內(nèi)、批間CV<5%。

3.回收率 95.9%~101.2%。

4.線(xiàn)性范圍 上限可達(dá)867μmol/L。