實(shí)驗(yàn)四　細(xì)菌的分離接種培養(yǎng)及菌落形態(tài)觀察

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

（1）初步掌握微生物的分離、接種和培養(yǎng)的基本方法。

（2）練習(xí)微生物接種、移植和培養(yǎng)的基本技術(shù)，掌握無(wú)菌操作技術(shù)。

二、實(shí)驗(yàn)原理

微生物接種技術(shù)是生物科學(xué)研究中最基本的操作技術(shù)。由于實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、培養(yǎng)基種類及容器等不同，為獲得生長(zhǎng)良好的純種微生物所用接種方法有所不同，如斜面接種、液體接種、固體接種和穿刺接種等。微生物接種必須在一個(gè)無(wú)雜菌污染的環(huán)境中進(jìn)行嚴(yán)格的無(wú)菌操作；同時(shí)，因接種方法的不同，常需采用不同的接種工具，如接種針、接種環(huán)、移液管和玻璃涂棒等。

三、實(shí)驗(yàn)器材

（一）菌種

大腸桿菌（E．coli）和檸檬色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）24h營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物，枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）12～18h營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物。

（二）培養(yǎng)基

滅菌的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基、牛肉膏蛋白胨半固體培養(yǎng)基、牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基。

（三）其他

無(wú)菌培養(yǎng)皿、無(wú)菌吸管、記號(hào)筆、接種環(huán)、接種針、酒精燈、火柴。

四、實(shí)驗(yàn)步驟

（一）接種

常用的接種方法有斜面接種法、平板接種法、液體接種法及試管半固體培養(yǎng)基的穿刺接種法。

常用的接種工具有接種針、接種環(huán)、接種鉤、接種圈、接種鏟或接種鋤、玻璃涂棒等（見(jiàn)圖4－1）。

將各細(xì)菌接種至液體培養(yǎng)基、半固體培養(yǎng)基及固體斜面有不同的操作步驟。

圖4－1　常用微生物的接種工具

a．接種環(huán)　1．塑料套　2．鋁柄　3．鎳鉻絲　4．接種針　5．接種鉤　6．接種環(huán)　
7．接種圈　8．接種鋤　b．玻璃刮鏟　9．三角形刮鏟　10．平刮鏟　11．移液管　12．滴管

1．試管菌種接種至液體培養(yǎng)基

（1）將菌種試管與待接種的試管培養(yǎng)基依次排列，挾于左手的拇指與食指之間，用右手的中指與食指或食指與小指拔出試管塞并挾出。

（2）置試管口于酒精火焰附近。

（3）將接種工具垂直插入酒精火焰中燒紅，再橫過(guò)火焰三次，然后放入有菌試管壁內(nèi)，于無(wú)菌的培養(yǎng)基表面待其冷卻。

（4）用接種環(huán)取少許菌種置于另一支液體培養(yǎng)基的試管中，在液體表面處的管內(nèi)壁上輕輕摩擦以及晃動(dòng)接種環(huán)，使菌體分散并從環(huán)上脫開(kāi)，進(jìn)入液體培養(yǎng)基。

（5）取出接種工具，試管口和試管塞進(jìn)行火焰滅菌。

（6）重新塞上試管塞。

（7）搖動(dòng)液體培養(yǎng)基試管，使菌體在培養(yǎng)液中分布均勻。

（8）燒死接種工具上殘留余菌，把試管和接種環(huán)放回原處。

2．試管菌種接至半固體培養(yǎng)基

試管半固體培養(yǎng)基利用穿刺接種，用接種針下端取菌種（針必須挺直），自半固體培養(yǎng)基的中心垂直刺入半固體培養(yǎng)基中，直至接近試管底部，但不要穿透，然后沿原穿刺線退出，塞上試管塞，燒灼接種針，如圖4－2所示。整個(gè)過(guò)程無(wú)菌操作。

圖4－2　穿刺接種

3．試管菌種接種至固體培養(yǎng)基（圖4－3）

（1）斜面接種。

①手持試管：將菌種和待接斜面的兩支試管用大拇指和其他四指握在左手中，使中指位于兩試管之間部位。斜面向上，并使它們位于水平位置。

②放松試管塞：右手將試管塞旋松，以便接種時(shí)拔出。

③取接種環(huán)：右手拿接種環(huán)，在火焰上將環(huán)端燒紅滅菌，然后將有可能伸入試管的其余部分均用火燒過(guò)滅菌。

④拔試管塞：用右手的無(wú)名指、小指和手掌邊先后拔出菌種管和待接試管的試管塞，然后讓試管口緩緩過(guò)火滅菌。

⑤環(huán)冷卻：將灼燒過(guò)的接種環(huán)伸入菌種管，先使環(huán)接觸沒(méi)有長(zhǎng)菌的培養(yǎng)基部分，使其冷卻。

⑥取菌種：待環(huán)冷卻后輕輕沾取少量的菌或孢子，然后將接種環(huán)移出接種管，注意不要使環(huán)的部分碰到管壁，取出后不可使環(huán)通過(guò)火焰。

⑦接種：在火焰旁邊迅速將沾有菌種的接種環(huán)伸入另一支待接斜面試管。從斜面培養(yǎng)基的底部向上部作“Z”形來(lái)回密集劃線，不要?jiǎng)澠婆囵B(yǎng)基，也可以用接種針在斜面培養(yǎng)基的中央拉一條線作斜面接種，以便觀察菌種的生長(zhǎng)特點(diǎn)。

⑧塞試管塞：取出接種環(huán)，灼燒試管口，并在火焰旁將試管塞塞上。塞試管塞時(shí)，不要用試管迎試管塞。

⑨環(huán)滅菌：將接種環(huán)燒紅滅菌。放下接種環(huán)，再將試管塞旋緊。

圖4－3　斜面接種時(shí)的無(wú)菌操作^[1]

（2）平板接種。操作步驟與4．2中微生物的平板劃線分離法相同。

（二）分離

分離微生物的方法有很多，其目的都是把混雜的微生物分離為單個(gè)細(xì)胞使其生長(zhǎng)繁殖，形成單個(gè)菌落，以便得到純菌種。

圖4－4　倒平板^[2]

1．倒平板的方法

右手持盛培養(yǎng)基的三角燒瓶置火焰旁邊，用左手將瓶塞拔出，瓶口保持對(duì)著火焰；然后用右手手掌邊緣或小指與無(wú)名指夾住瓶塞（也可將瓶塞放在左手邊緣或小指與無(wú)名指之間夾住。如果三角燒瓶?jī)?nèi)的培養(yǎng)基一次用完，瓶塞則不必夾在手中）。左手持培養(yǎng)皿并將皿蓋在火焰旁打開(kāi)一縫，迅速倒入培養(yǎng)基約15mL，加蓋后輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)皿，使培養(yǎng)基均勻分布在培養(yǎng)皿底部，然后平置于桌面上，待凝固后即為平板。

2．劃線的方法

平板凝固后，用接種環(huán)取相應(yīng)的菌苔一環(huán)在平板上劃線。

（1）連續(xù)劃線法：將挑取樣品的接種環(huán)在平板培養(yǎng)基表面作連續(xù)劃線，如圖4－5左所示。

（2）三區(qū)劃線法：用接種環(huán)以無(wú)菌操作挑取菌種1環(huán)，先在培養(yǎng)基的第一區(qū)（約占整個(gè)平板面積的一半）作第一次連續(xù)劃線，再轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿約60°角，并將接種環(huán)上殘余物燒掉，待冷卻后通過(guò)第一次劃線部分作第二次劃線，然后作第三次劃線，如圖4－5中所示。劃線完畢，蓋上皿蓋，倒置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

（3）分區(qū)劃線法：將挑取樣品的接種環(huán)先在培養(yǎng)基上劃一條線，將接種環(huán)上殘余物燒掉，轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿從第一條線上連續(xù)劃4～6條線，再將接種環(huán)上殘余物燒掉，轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿從第二次劃的線上劃過(guò)連續(xù)劃4～6條線，依次類推，直至劃滿平皿為止，如圖4－5右所示。

挑取單個(gè)菌落接種于斜面培養(yǎng)基上，如果不純，再移植純化，最后得到純培養(yǎng)。

圖4－5　平板劃線分離的劃線方法

（三）培養(yǎng)

（1）將接種的細(xì)菌培養(yǎng)基放在32～37℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)24h后用于觀察。

（2）平板培養(yǎng)基置于恒溫箱內(nèi)倒置培養(yǎng)。

（3）細(xì)菌的培養(yǎng)特征如圖4－6所示。

圖4－6　細(xì)菌的培養(yǎng)特征

五、實(shí)驗(yàn)記錄

（1）固體平板培養(yǎng)基上的培養(yǎng)特征表

（2）固體斜面培養(yǎng)基上的培養(yǎng)特征表

（3）半固體培養(yǎng)基中的培養(yǎng)特征表。

（4）液體培養(yǎng)基中的培養(yǎng)特征表。

六、思考題

（1）平板菌落計(jì)數(shù)法中，為什么熔化后的培養(yǎng)基需要冷卻至45℃左右才能倒平板？

（2）當(dāng)平板上長(zhǎng)出的菌落不是均勻分散的，而是集中在一起時(shí)，你認(rèn)為問(wèn)題出在哪里？

參考文獻(xiàn)

［1］沈萍，陳向東．微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)［M］．4版．北京：高等教育出版社，2007．

參考資料

［1］袁勇軍．應(yīng)用基礎(chǔ)生物實(shí)驗(yàn)技術(shù)．浙江萬(wàn)里學(xué)院．

【注釋】

[1]引自百度圖庫(kù)http：／／image．baidu．com／i？ct＝503316480＆z＝＆tn＝baiduimagedetail＆ipn＝d＆word＝斜面接種時(shí)的無(wú)菌操作。

[2]引自沈萍等《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》第3版。