種子細(xì)胞的準(zhǔn)備_組織工程學(xué)實(shí)驗(yàn)技

一、角膜上皮細(xì)胞的培養(yǎng)

角膜上皮是一種自我更新組織，增殖和分化之間的平衡維持它的穩(wěn)定。上皮來(lái)源的最佳選擇是干細(xì)胞，可以從四個(gè)途徑獲得：①角膜緣干細(xì)胞培養(yǎng)擴(kuò)增；②胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)分化；③皮膚干細(xì)胞橫向分化；④骨髓基質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化。

（一）角膜緣干細(xì)胞培養(yǎng)擴(kuò)增

1．培養(yǎng)液

（1）基礎(chǔ)培養(yǎng)基：可以采用的培養(yǎng)基有DMEM、DMEM－F12等培養(yǎng)基，后者中的鈣離子有利于細(xì)胞的貼壁生長(zhǎng)，所以被廣泛使用。

（2）血清：血清中含有大量促生長(zhǎng)物質(zhì)，尤其對(duì)角膜緣干細(xì)胞的增殖有促進(jìn)作用。但是采用血清培養(yǎng)后，不明成分增多，不便于研究角膜緣干細(xì)胞的增殖和分化的調(diào)節(jié)的因素。因此國(guó)外許多學(xué)者用無(wú)血清培養(yǎng)的方法，用MCDB151基礎(chǔ)培養(yǎng)基結(jié)合一些添加因子成分來(lái)培養(yǎng)角膜上皮細(xì)胞收到了較好的效果。

（3）添加因子：角膜上皮細(xì)胞體外培養(yǎng)時(shí)，常常需要添加各種因子以盡量模擬體內(nèi)時(shí)細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)，來(lái)提高細(xì)胞的增殖活性，保持相對(duì)穩(wěn)定的生物學(xué)特性。其中胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、氫化可的松、異丙腎上腺素、腺苷、三碘甲狀腺原氨酸、表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子，成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子等成分的添加有利于角膜上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)。

（4）飼養(yǎng)層細(xì)胞：飼養(yǎng)層細(xì)胞不但能夠提供角膜上皮細(xì)胞多種生長(zhǎng)刺激因子，同時(shí)飼養(yǎng)層細(xì)胞和角膜上皮細(xì)胞之間的接觸有利于細(xì)胞之間信號(hào)的傳導(dǎo)，促進(jìn)細(xì)胞的增殖和分化。接種在飼養(yǎng)層上的細(xì)胞往往能夠保持旺盛的增殖能力。一般多采用經(jīng)射線照射或絲裂霉素處理過(guò)的3T3細(xì)胞、Swiss鼠胚胎成纖維細(xì)胞等作為飼養(yǎng)層。

（5）氣液交界面：眼表生理?xiàng)l件下暴露于空氣中，氣液交界面對(duì)上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)分化起到極為重要的作用。采用氣液界面的培養(yǎng)方式，上皮細(xì)胞能夠形成復(fù)層結(jié)構(gòu)，而不會(huì)因?yàn)榧?xì)胞之間的接觸性抑制而死亡。

2．原代培養(yǎng)

（1）材料和溶液

①角膜材料：可以取自人眼、兔眼或者牛眼，人眼材料最好取自胎兒。因?yàn)樘旱慕悄ど掀ぜ?xì)胞的活力高，在體外的增殖能力強(qiáng)，體外培養(yǎng)的時(shí)候容易成功。

②特殊器械：虹膜恢復(fù)器、尖刀片、角膜剪等。

③角膜上皮細(xì)胞培養(yǎng)液，消毒液（1∶5　000的升汞溶液與100U／ml的慶大霉素生理鹽水），平衡鹽溶液如D－Hanks液，消化液（0．25%胰蛋白酶－0．01%EDTA混合溶液）等。

④細(xì)胞培養(yǎng)所需儀器：細(xì)胞培養(yǎng)箱、相差倒置顯微鏡、培養(yǎng)瓶等。

（2）取材

①摘取眼球1只，用升汞溶液與慶大霉素生理鹽水消毒液交替沖洗2次，以洗去眼球表面殘留的血污并做初步消毒處理；

②無(wú)菌條件下，于角膜緣與白色鞏膜移行處做一環(huán)形小切口，深度1／4～1／3角膜厚度；

③用虹膜恢復(fù)器順切口處插入，沿角膜弧度鈍性分離角膜上皮板層；

④待角膜上皮層被完全分離之后，環(huán)形剪下角膜上皮層組織。用10mm環(huán)鉆將角膜上皮板層分成中央上皮和角膜緣上皮組織。將所得角膜緣組織置于培養(yǎng)液或平衡鹽溶液中。取材過(guò)程中注意防止上皮層干燥，以免影響細(xì)胞活性；

采用分離板層的方法進(jìn)行原代培養(yǎng)一方面可以減少成纖維細(xì)胞的污染；另一方面薄層組織塊有利于組織貼壁牢固，減少脫壁現(xiàn)象發(fā)生；最后薄層角膜組織有利于細(xì)胞從組織塊中“爬出”，縮短了原代細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間，提高了培養(yǎng)效率。

（3）接種和培養(yǎng)：角膜上皮細(xì)胞的體外培養(yǎng)接種的方法有組織塊培養(yǎng)法、消化培養(yǎng)法、飼養(yǎng)層培養(yǎng)法，氣液界面培養(yǎng)法等。下面分別對(duì)這四種方法進(jìn)行詳述。

① 組織塊培養(yǎng)法

A．將中央、周邊、角膜緣角膜上皮層組織片用培養(yǎng)液或者Hanks液稍作洗滌。將上皮面朝上，平鋪于培養(yǎng)板中。用無(wú)菌剃須刀片將其切成1～1．5mm大小的小片組織塊（植塊）。

B．用無(wú)齒小鑷子將組織塊挑起，上皮面朝下平貼于培養(yǎng)板或培養(yǎng)瓶底壁。

C．37℃恒溫箱中靜置20～60min，待植塊牢固黏附后（即組織塊稍干時(shí)），再加入少量的培養(yǎng)液。細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)2d，盡量減少培養(yǎng)液的晃動(dòng)，避免組織塊脫落。

D．按常規(guī)方法繼續(xù)培養(yǎng)。3d后開(kāi)始換液，每周換液2次。相差倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)情況。

此種培養(yǎng)方法更接近角膜上皮細(xì)胞的體內(nèi)生存環(huán)境，細(xì)胞之間、細(xì)胞和基底膜之間的相互接觸和信號(hào)傳遞，都類似于生理狀態(tài)，所以原代細(xì)胞生長(zhǎng)比較快，細(xì)胞一般7d便融合成單層（圖14－3，彩圖43）。顯微鏡下觀察細(xì)胞可見(jiàn)：中央部角膜上皮細(xì)胞大而圓，細(xì)胞扁平，呈多邊形，細(xì)胞的生長(zhǎng)速度相對(duì)較慢；周邊部角膜上皮細(xì)胞較中央部上皮細(xì)胞小而圓，細(xì)胞之間的連接緊密，細(xì)胞生長(zhǎng)速度較中央部細(xì)胞快；而角膜緣上皮細(xì)胞形態(tài)最小，細(xì)胞呈層狀向周邊鋪展，生長(zhǎng)速度最快。此外剪碎的組織塊也可以接種到飼養(yǎng)層或羊膜上進(jìn)行培養(yǎng)，細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)良好，顯示出良好的增殖能力，用于眼表的重建。

圖14－3　組織塊培養(yǎng)法（猴角膜緣組織）

② 消化培養(yǎng)法

A．取材后，將角膜上皮層組織的上皮面朝上，平鋪于培養(yǎng)皿中。加入0．25%胰蛋白酶－0．01%EDTA混合消化液，于37℃條件下消化15～30min，用含有血清的終止液終止消化，收集細(xì)胞到離心管中。培養(yǎng)皿中加入Dispase（1．2U／ml）消化液37℃消化上皮層3h左右。預(yù)先用胰酶短時(shí)間消化可以增加表層上皮細(xì)胞之間的通透性，有利于Dispase向深層角膜上皮組織的滲入，縮短了用酶消化的時(shí)間，減少了上皮細(xì)胞的損傷和活力的下降。

B．輕輕吹打細(xì)胞，使其分散成單個(gè)的細(xì)胞制成細(xì)胞懸液。將細(xì)胞移入離心管中。

C．800～1　000r／min離心8～10min。棄上清液，用培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，計(jì)數(shù)。

D．消化后的細(xì)胞可以直接接種到培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，也可以接種到飼養(yǎng)層或羊膜等培養(yǎng)載體表面。

E．加入適量上皮細(xì)胞培養(yǎng)液，37℃，飽和濕度、5%CO2、95%空氣的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每周換液2次。相差倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)情況。

討論：消化培養(yǎng)法往往得到的細(xì)胞比較純（圖14－4，彩圖44），雜細(xì)胞少。胰酶結(jié)合Dispase酶消化細(xì)胞既減少了其他雜細(xì)胞的污染，又保證了角膜上皮細(xì)胞良好旺盛的增殖能力。

圖14－4　酶消化法培養(yǎng)（人角膜緣上皮細(xì)胞）

③ 飼養(yǎng)層培養(yǎng)法

A．3T3飼養(yǎng)層細(xì)胞的制備：在3T3細(xì)胞接近融合狀態(tài)時(shí)，培養(yǎng)液中加入10μg／ml絲裂霉素C，繼續(xù)培養(yǎng)2h。

B．用培養(yǎng)液洗3次，最后一次于37℃下洗10～20min。

C．按常規(guī)方法用胰蛋白酶消化收集3T3細(xì)胞，以細(xì)胞密度2．5×104個(gè)／cm2種植在培養(yǎng)瓶中。

D．將角膜上皮組織塊或消化后角膜細(xì)胞，接種到預(yù)先準(zhǔn)備好的飼養(yǎng)層上進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。

討論：處理后的飼養(yǎng)層細(xì)胞失去了增殖能力，卻保存了細(xì)胞分泌功能?？梢蕴峁┙悄ぜ?xì)胞生長(zhǎng)所需的各種營(yíng)養(yǎng)因子，還可以通過(guò)細(xì)胞和細(xì)胞的接觸傳遞細(xì)胞增殖、分裂信號(hào)，此外還能夠抑制其他雜細(xì)胞的生長(zhǎng)，有利于角膜上皮細(xì)胞的純化。接種在飼養(yǎng)層上的角膜上皮通常生長(zhǎng)旺盛。

④ 氣液界面培養(yǎng)：氣液界面培養(yǎng)是將消化后的細(xì)胞或組織塊放在有氣液界面條件下進(jìn)行培養(yǎng)的一種方法。良好的氣液界面有利于角膜上皮細(xì)胞的增殖和分化，氣液界面的形成可以用自制的培養(yǎng)支架，讓上皮細(xì)胞暴露于空氣中；也可以用旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)法進(jìn)行。氣液界面培養(yǎng)促進(jìn)細(xì)胞形成復(fù)層結(jié)構(gòu)和細(xì)胞間連接緊密。

（4）細(xì)胞分離純化：在細(xì)胞原代培養(yǎng)過(guò)程中，不可避免的存在雜細(xì)胞的污染。少量的雜細(xì)胞不僅對(duì)角膜上皮細(xì)胞無(wú)害，反而有利于細(xì)胞的增殖；而且臨床上眼表重建和生物角膜的構(gòu)建不需要完全純化的角膜上皮細(xì)胞。但是如果培養(yǎng)的細(xì)胞中其他的細(xì)胞占優(yōu)勢(shì)時(shí)往往會(huì)抑制角膜上皮細(xì)胞的增殖。這時(shí)需要對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分離純化。除了上述的分離角膜板層減少雜細(xì)胞的污染外，在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中還可以用以下的方法對(duì)細(xì)胞進(jìn)行純化：

①Dispase消化法：此種消化的特點(diǎn)是Dispase作用于上皮基底膜的結(jié)合處，僅破壞半橋粒結(jié)構(gòu)，對(duì)角膜上皮細(xì)胞的損傷較少，利用此法較好保持了細(xì)胞活力的同時(shí)又可獲得較純的角膜緣上皮細(xì)胞。因此Dispase消化法是一種較好的方法，在國(guó)外研究中得到了廣泛的應(yīng)用。

② 機(jī)械刮除法：對(duì)局部聚集生長(zhǎng)的雜細(xì)胞在顯微鏡下進(jìn)行刮除，去除大部分雜細(xì)胞的污染。此種方法只是粗略去除雜細(xì)胞的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)，減少其對(duì)角膜上皮細(xì)胞的競(jìng)爭(zhēng)。

③差異黏附法：此種方法是利用細(xì)胞的黏附力不同，而使細(xì)胞得以分離的一種方法。細(xì)胞傳代時(shí)可以利用不同細(xì)胞對(duì)胰酶的反應(yīng)時(shí)間不同，角膜上皮細(xì)胞由于細(xì)胞之間、細(xì)胞和瓶壁之間連接非常緊密，往往需要較長(zhǎng)消化時(shí)間；而其他細(xì)胞如成纖維細(xì)胞所需的時(shí)間短，利用此差異使細(xì)胞純化。另外不同細(xì)胞接種貼壁時(shí)間也不盡相同，觀察細(xì)胞貼壁時(shí)間的差異也可以對(duì)細(xì)胞進(jìn)行初步的分離純化。

④其他：此外還有Ⅳ型膠原差異黏附法、5－FU毒性選擇法、n－庚醇處理法、密度梯度離心等方法用于角膜緣干細(xì)胞的分離和純化，效果也不盡相同。

（5）細(xì)胞傳代、凍存和復(fù)蘇：體外培養(yǎng)的角膜上皮細(xì)胞接近融合成單層，如果不進(jìn)行氣液界面培養(yǎng)，多需要進(jìn)行傳代培養(yǎng)。一般選擇細(xì)胞的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期進(jìn)行消化傳代。吸去培養(yǎng)液，用PBS液輕輕漂洗細(xì)胞，去除殘存培養(yǎng)液中的血清，加入0．25%胰蛋白酶－0．01%EDTA混合溶液，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的消化程度。待細(xì)胞開(kāi)始松散，變圓時(shí)，倒去消化液，加入含血清的培養(yǎng)液，用吸管輕輕吹打瓶壁，讓細(xì)胞從瓶壁上脫落下來(lái)，收集細(xì)胞到離心管中，800～1　000r／min離心8～10min，后去掉上清液，用培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，按照合適的密度（通常按1∶2傳代）接種到新的培養(yǎng)瓶中。放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中37℃、5% CO2、95%空氣飽和濕度培養(yǎng)。

原代細(xì)胞的消化往往需要較長(zhǎng)的時(shí)間，除了保證胰酶的效力外，細(xì)胞漂洗要徹底，必要時(shí)37℃消化可以縮短消化時(shí)間，有時(shí)為了避免細(xì)胞長(zhǎng)時(shí)間接觸胰酶造成的損害，分段消化法也是可取的。

①細(xì)胞凍存：可以對(duì)原代細(xì)胞進(jìn)行保種，以備以后使用。細(xì)胞傳代和凍存的最佳時(shí)機(jī)是70%～80%融合的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞在換液后2h左右，常規(guī)消化細(xì)胞后，移入離心管，800～1　000r／min離心10min，棄清液，加入凍存液。凍存液中二甲基亞砜：上皮細(xì)胞培養(yǎng)液＝1∶9、細(xì)胞量為l×l06／ml，分裝入凍存管中，將凍存管放入自制的塑料泡沫盒中，密閉封好后放入－86℃冰箱中過(guò)夜保存，次日轉(zhuǎn)到－196℃液氮中長(zhǎng)期保存，并做好記錄。定期檢查液氮罐中液氮量，保證罐內(nèi)的溫度。

②細(xì)胞復(fù)蘇：準(zhǔn)備37～40℃溫水一杯，將凍存細(xì)胞從液氮中取出后立即放入水浴中，不斷搖晃加速細(xì)胞的復(fù)溫，力爭(zhēng)在30s內(nèi)使凍存管中的冰完全融解。將凍存管中的細(xì)胞懸液移入事先加有5ml培養(yǎng)液的離心管中，800～1　000r／min離心8min，去除凍存液常溫下對(duì)細(xì)胞的毒性作用。離心后去除上清液，用上皮細(xì)胞培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，按照適當(dāng)?shù)拿芏葘⒓?xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中，常規(guī)換液培養(yǎng)，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞復(fù)蘇后的生長(zhǎng)狀態(tài)。

凍存細(xì)胞的復(fù)溫速度對(duì)細(xì)胞的活性影響非常大，所以復(fù)蘇時(shí)應(yīng)該在最短時(shí)間內(nèi)讓冰晶融解。一般細(xì)胞復(fù)蘇后的第2天換液一次，減少殘留的二甲基亞砜對(duì)細(xì)胞的毒害作用。

（二）胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)分化

胚胎干細(xì)胞（embryonic　stem　cell，ESC）具有分化成各種組織細(xì)胞的潛能。眾所周知，微環(huán)境的調(diào)控是干細(xì)胞增殖和分化的外部原因。在體外最大限度的模擬體內(nèi)微環(huán)境，能誘導(dǎo)ES細(xì)胞向某一特定方向分化。目前，應(yīng)用胚胎干細(xì)胞定向分化為角膜上皮細(xì)胞還處于起步階段，需要進(jìn)一步深入研究，以下實(shí)驗(yàn)方法僅供參考。

1．兔角膜緣上皮細(xì)胞體外誘導(dǎo)ESC分化　ES－D3，ES－BALB／c，ES－GFP（轉(zhuǎn)染綠色熒光蛋白基因的胚胎干細(xì)胞，圖14－5，彩圖45；圖14－6，彩圖46）接種在經(jīng)絲裂霉素處理過(guò)的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層上培養(yǎng)，保持其未分化狀態(tài)。誘導(dǎo)前將ESC移出飼養(yǎng)層，傳2～3代去除飼養(yǎng)層細(xì)胞。兔角膜緣上皮細(xì)胞2～4代用于誘導(dǎo)ES細(xì)胞的分化。

圖14－5　消化后的ES－ GFP細(xì)胞

圖14－6　ES－ GFP克隆

取2～4代角膜上皮細(xì)胞接種于六孔Transwell（Transwell為一雙層共培養(yǎng)系統(tǒng)，兩層之間由帶孔的多聚碳酯膜濾膜隔開(kāi)，圖14－7，彩圖47）上層培養(yǎng)板中，2d后，待角膜上皮細(xì)胞完全貼壁，70%～80%融合后，將ESC接種于Transwell下層培養(yǎng)板中，接種密度5×105細(xì)胞／孔，采用無(wú)LIF　ES細(xì)胞完全培養(yǎng)基，每日半量換液。倒置相差顯微鏡下觀察ES細(xì)胞形態(tài)。共培養(yǎng)96h后，免疫組化顯示：下層分化的ES細(xì)胞大部分細(xì)胞AE5（CK3／12）陽(yáng)性顯色（圖14－8，彩圖48）。透射電鏡顯示誘導(dǎo)分化后ES細(xì)胞表面大量微絨毛，細(xì)胞間可見(jiàn)胞突及凹陷鑲嵌形成緊密連接，均為上皮細(xì)胞較典型特征（圖14－9）。

圖14－7　Transwell培養(yǎng)板

圖14－8　誘導(dǎo)分化的ESC　AE5（＋）

圖14－9　誘導(dǎo)分化后ESC間緊密連接

2．羊膜對(duì)ES細(xì)胞的誘導(dǎo)作用　羊膜組織對(duì)ES細(xì)胞也有一定的定向誘導(dǎo)作用，與羊膜組織共同培養(yǎng)的ES細(xì)胞形態(tài)向上皮樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化，羊膜與RA共同作用可誘導(dǎo)ES細(xì)胞向上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化并表達(dá)細(xì)胞角蛋白。

（1）人羊膜的取材及處理（圖14－10）：無(wú)菌狀態(tài)取健康產(chǎn)婦剖宮產(chǎn)胎盤，剝離羊膜，鈍性分離去除絨毛膜，2　000U／ml慶大霉素生理鹽水沖洗干凈血污，用剪刀剪成約5cm大小，基底面朝下平鋪在硝酸纖維素膜上，浸泡在1　000U／ml慶大霉素生理鹽水中，30min后，在超凈工作臺(tái)中將其移入盛有DMEM培養(yǎng)基的平皿中。無(wú)菌條件下將羊膜剪成比6孔培養(yǎng)板孔徑稍大的圓形，平鋪在6孔培養(yǎng)板底部，上皮面向上，覆蓋整個(gè)孔底部，倒置于37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中。4h后，待羊膜貼附后，翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)板，加入不含LIF的ES細(xì)胞培養(yǎng)基，培養(yǎng)過(guò)夜，次日接種ES細(xì)胞。

（2）ES－GFP細(xì)胞接種于羊膜表面培養(yǎng)：將生長(zhǎng)良好的ES細(xì)胞消化成單細(xì)胞懸液，用無(wú)LIF的ES細(xì)胞培養(yǎng)液調(diào)細(xì)胞濃度5× 105／ml。接種1ml于鋪被好的羊膜表面，加足量無(wú)LIF的ES用完全培養(yǎng)基。每日半量換液1～2次。

接種在羊膜上的ES－GFP細(xì)胞貼附于羊膜呈集落生長(zhǎng)，1d即可形成小的克隆，2～3d克隆逐漸增大，集落邊緣不夠清楚，表面變粗

圖14－10　人羊膜組織

注：1．羊膜上皮；2．基底膜；3．無(wú)血管基質(zhì)

糙，有小圓形的隆起，集落內(nèi)細(xì)胞界線模糊；4～5d，克隆繼續(xù)增大，細(xì)胞堆積隆起更明顯，有一部分細(xì)胞集落變得較大而扁平，集落內(nèi)細(xì)胞界限較清楚，多角形、菱形細(xì)胞鑲嵌。免疫組化顯示羊膜上分化的ES細(xì)胞p63陽(yáng)性（圖14－11，彩圖49）與CD29陽(yáng)性。

圖14－11　羊膜上分化的ESC　p63（＋）

3．角膜緣基質(zhì)的局部誘導(dǎo)作用　用促進(jìn)分化劑RA（視黃酸）啟動(dòng)胚胎干細(xì)胞分化后，將胚胎干細(xì)胞與表層角膜緣基質(zhì)共同培養(yǎng)，ES細(xì)胞形態(tài)向上皮樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化，容易形成單層融合成片結(jié)構(gòu)，進(jìn)行細(xì)胞角蛋白的免疫組化鑒定，發(fā)現(xiàn)分化細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞角蛋白，證實(shí)角膜組織與RA共同作用可誘導(dǎo)ES細(xì)胞向上皮樣細(xì)胞分化。但是分化細(xì)胞傳代能力弱，推測(cè)與培養(yǎng)條件有關(guān)，可能類似于胚胎干細(xì)胞建系中傳至4～6代的情況。

4．相關(guān)細(xì)胞因子的誘導(dǎo)作用　與表層角膜緣基質(zhì)共同培養(yǎng)的ES細(xì)胞，培養(yǎng)基中添加KGF、EGF等細(xì)胞因子后，雖然分化細(xì)胞形態(tài)向上皮樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化，但細(xì)胞不表達(dá)角蛋白，說(shuō)明ES細(xì)胞的定向誘導(dǎo)不是由單獨(dú)一種因子來(lái)完成的。

5．晶狀體上皮細(xì)胞在維持角膜緣干細(xì)胞功能方面存在一定作用　胚胎發(fā)育過(guò)程中，由晶狀體上皮誘導(dǎo)其表面的細(xì)胞分化，部分細(xì)胞繼續(xù)分化形成角膜上皮，而部分位于角膜緣處細(xì)胞保持靜止?fàn)顟B(tài)，則成為成體組織中的角膜緣干細(xì)胞。因此對(duì)晶狀體細(xì)胞在維持角膜緣干細(xì)胞特性方面的作用值得探討。晶狀體上皮細(xì)胞作為飼養(yǎng)層可使ES細(xì)胞表達(dá)角膜緣干細(xì)胞標(biāo)記p63。

成體角膜緣上皮細(xì)胞、角膜基質(zhì)均存在著調(diào)控角膜上皮細(xì)胞分化發(fā)育的微環(huán)境。成體角膜緣上皮及角膜緣基質(zhì)存在細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)，包括TGF－α、IL－1β、PDGF、IGF－I、TGF－α、LIF、bFGF、KGF、HGF、M－CSF及IL－8，在角膜胚胎發(fā)育、創(chuàng)傷愈合、及某些上皮相關(guān)疾病過(guò)程中調(diào)節(jié)角膜緣干細(xì)胞及角膜上皮細(xì)胞的增殖、分化、移行等生物活性。角膜基質(zhì)除通過(guò)ECM發(fā)揮直接接觸性調(diào)控基質(zhì)外，還含有許多自分泌和旁分泌的細(xì)胞因子及其受體，它們共同構(gòu)成了復(fù)雜的細(xì)胞因子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

采用角膜緣上皮細(xì)胞，利用雙層Transwell非接觸共培養(yǎng)系統(tǒng)結(jié)果顯示，分化的細(xì)胞光鏡、電鏡檢查均顯示具有典型上皮細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)，呈多角形，形態(tài)單一，細(xì)胞群體呈膜狀生長(zhǎng)，大量的微絨毛及細(xì)胞間緊密連接，并表達(dá)角膜上皮特異性標(biāo)志CK3／CK12。提示角膜緣上皮細(xì)胞和晶狀體上皮細(xì)胞產(chǎn)生的分泌性活性因子具有誘導(dǎo)ESC向角膜上皮細(xì)胞分化的能力。誘導(dǎo)角膜緣干細(xì)胞及角膜上皮細(xì)胞的分化需要更多因素的共同作用，這一過(guò)程可能與局部細(xì)胞因子的類型及濃度密切相關(guān)。

（三）成體干細(xì)胞橫向分化

來(lái)源于各種組織的成體干細(xì)胞事實(shí)上并未定型，它們的分化潛能遠(yuǎn)較先前所認(rèn)為的要寬，一旦處于一個(gè)嶄新的環(huán)境中，他們可能分化為其他類型的細(xì)胞，生物學(xué)家們稱這種現(xiàn)象為成體干細(xì)胞的可塑性（plasticity）或橫向分化（transdifferentiation）。在當(dāng)前，多國(guó)政府迫于倫理道德上的壓力禁止科學(xué)家進(jìn)行胚胎研究，因而研究成體干細(xì)胞的可塑性更加有意義。在先天性無(wú)虹膜癥患者，角膜緣干細(xì)胞缺如，應(yīng)用自體的成體干細(xì)胞可塑性進(jìn)行重建眼表可以避免免疫排斥的發(fā)生。目前人們多根據(jù)細(xì)胞形體和細(xì)胞特異性表面標(biāo)志來(lái)判斷成體干細(xì)胞是否分化成了其他細(xì)胞，還沒(méi)有充分的證據(jù)表明這些細(xì)胞也具有相應(yīng)的功能。

1．皮膚干細(xì)胞分化為角膜上皮細(xì)胞

（1）皮膚干細(xì)胞的培養(yǎng)擴(kuò)增：將取得的皮膚標(biāo)本去除皮下組織，剪成1～2mm寬的皮條，用0．25%胰酶浸泡，置于4℃過(guò)夜，獲得消化下來(lái)的皮膚上皮細(xì)胞，用皮膚上皮細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)傳代，獲得1～4代的細(xì)胞，再用Ⅳ型膠原黏附法獲得皮膚干細(xì)胞。

（2）角膜基質(zhì)片的制備：取得兔角膜后，先用普通消化液（將0．25%胰酶以1∶1的比例加入0．02%EDTA）浸泡，37℃0．5h，再用Dispase浸泡，37℃消化2h。每次消化后用PBS洗去消化下來(lái)的細(xì)胞。在解剖顯微鏡下觀察，確保角膜上皮細(xì)胞完全被消化下來(lái)，無(wú)殘留。

（3）接種：將獲得的1～4代人皮膚干細(xì)胞種植在去上皮的兔角膜基上，每個(gè)角膜片上種植（0．5～1）×105個(gè)細(xì)胞，37℃培養(yǎng)。使用的培養(yǎng)液仍然是皮膚上皮細(xì)胞培養(yǎng)液。5～6h后進(jìn)行氣液界面培養(yǎng)，連續(xù)10d。免疫組化顯示K3／K12（角膜上皮特異性）和K19（皮膚干細(xì)胞的特異性表面標(biāo)志，角膜緣干細(xì)胞的標(biāo)志之一）均呈陽(yáng)性。

2．誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向角膜上皮細(xì)胞分化　從胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)分化來(lái)的角膜上皮細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞有以下不足：①細(xì)胞來(lái)自異體，仍然存在免疫排斥反應(yīng)的問(wèn)題；②用來(lái)誘導(dǎo)分化的胚胎干細(xì)胞最好不是長(zhǎng)期傳代的細(xì)胞，以便于誘導(dǎo)，結(jié)合目前干細(xì)胞研究的最新進(jìn)展，誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞定向分化的研究正在進(jìn)行，經(jīng)誘導(dǎo)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞無(wú)論是從形態(tài)學(xué)還是特異性蛋白表達(dá)，均符合神經(jīng)細(xì)胞特征，為過(guò)渡到利用患者的自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化為角膜上皮細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞，構(gòu)建類自體生物眼組織奠定基礎(chǔ)。

二、角膜基質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)

角膜基質(zhì)細(xì)胞可以從角膜實(shí)質(zhì)層獲得：去除上皮和內(nèi)皮層后，基質(zhì)組織塊置DMEM加10%胎牛血清和抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，上皮培養(yǎng)被基質(zhì)細(xì)胞污染后改為上述培養(yǎng)基也可獲得，傳代后上皮細(xì)胞因營(yíng)養(yǎng)不足而被淘汰，即可獲得較純的基質(zhì)細(xì)胞。

三、角膜內(nèi)皮細(xì)胞

角膜內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)：沿角膜緣環(huán)行剪下角膜 ，將角膜內(nèi)皮和后彈力層撕下，用慶大霉素生理鹽水洗2次，加D－MEN培養(yǎng)液配制的膠原酶（200U／ml）溶液，37℃下消化48h。分裝接種于塑料培養(yǎng)瓶。加含胎牛血清和添加因子的培養(yǎng)液，置5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況。細(xì)胞貼壁后，每3d換液1次。細(xì)胞生長(zhǎng)融合接近融合時(shí)，用0．25%胰蛋白酶消化進(jìn)行細(xì)胞傳代培養(yǎng)。

在角膜內(nèi)皮細(xì)胞方面，培養(yǎng)體系還不夠成熟，培養(yǎng)液成分和相關(guān)促分化、抑制凋亡的細(xì)胞因子的篩選有待于進(jìn)一步研究。Kofff等（1998）設(shè)計(jì)的三維球狀培養(yǎng)模型，克服了內(nèi)皮細(xì)胞單細(xì)胞懸浮培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞很快凋亡的難點(diǎn)；Blake等（1997）采用牛角膜內(nèi)皮細(xì)胞和基質(zhì)包被培養(yǎng)皿培養(yǎng)人角膜內(nèi)皮細(xì)胞，結(jié)果細(xì)胞不但可以正常生長(zhǎng)，而且形態(tài)、核型均正常，表明牛角膜內(nèi)皮細(xì)胞和基質(zhì)能夠促進(jìn)人角膜內(nèi)皮細(xì)胞增殖。研究發(fā)現(xiàn)人角膜內(nèi)皮細(xì)胞上有bFGF、FGF受體（flg型）、EGF受體和TGFβ1表達(dá)，合適的培養(yǎng)條件和添加相關(guān)細(xì)胞因子，如KGF、EGF、HGF、VEGF、FGF－2、bFGF均能促進(jìn)角膜內(nèi)皮細(xì)胞增殖，維持正常細(xì)胞形態(tài)。Engelmann等（1995）報(bào)道利用他們?cè)O(shè)計(jì)的F09sr培養(yǎng)液，可以保證角膜內(nèi)皮細(xì)胞融合時(shí)的正常形態(tài)。Bohnke等（1998）介紹他們培養(yǎng)20代以上（1年以上）仍有NSE染色，并保持其鵝卵石樣外觀。