皮膚由表皮與真皮兩部分組成。表皮是皮膚的淺層，為角化的復(fù)層扁平上皮，可分為基底層、棘層、顆粒層、透明層、角質(zhì)層5層。只有基底細(xì)胞具有增殖能力。表皮細(xì)胞主要有兩類(lèi)，即角質(zhì)形成細(xì)胞（keratinocytes，亦稱(chēng)角朊細(xì)胞，或角蛋白細(xì)胞）和非角質(zhì)形成細(xì)胞（non－keratinocytes）。前者占表皮細(xì)胞的絕大多數(shù)，其特點(diǎn)為基底層細(xì)胞借橋粒與基底膜相連，有活躍的細(xì)胞分裂；可產(chǎn)生角蛋白（keratin），胞質(zhì)內(nèi)含有張力原纖維（tonofibril）。非角質(zhì)形成細(xì)胞數(shù)量少，分散存在于角朊細(xì)胞之間，包括黑色素細(xì)胞（Malanocytes）、朗格漢斯細(xì)胞（Langerhans　cell）、梅克爾細(xì)胞（Merkel　cell），它們各有自身特定的功能，與表皮角化無(wú)直接關(guān)系。一般所說(shuō)的表皮細(xì)胞指角質(zhì)形成細(xì)胞，因其占絕大多數(shù)。真皮主要由致密結(jié)締組織構(gòu)成，主要細(xì)胞成分是成纖維細(xì)胞。

本節(jié)主要介紹表皮角質(zhì)形成細(xì)胞的分離與培養(yǎng)。

1950年Billingharn第一次成功地在不損傷表皮細(xì)胞活力的同時(shí)用胰蛋白酶消化法將表皮從真皮分離下來(lái)。1975年，Rheinwald和Green在體外連續(xù)培養(yǎng)人類(lèi)表皮角質(zhì)形成細(xì)胞獲得成功，其要點(diǎn)是以小鼠3T3細(xì)胞作為角質(zhì)形成細(xì)胞的飼養(yǎng)層，并使用含胎牛血清的培養(yǎng)液。這一里程碑式的成就為人類(lèi)修復(fù)皮膚缺損展示了美好的前景。1981年O’Connor首次應(yīng)用此方法在體外培養(yǎng)出適于移植的人自體表皮細(xì)胞膜片。在用于臨床的表皮細(xì)胞體外培養(yǎng)過(guò)程中，因使用的3T3細(xì)胞是異種細(xì)胞，?？僧a(chǎn)生對(duì)人體不利的抗原和蛋白質(zhì)，產(chǎn)生免疫排斥反應(yīng)。所以，為尋求接近體內(nèi)環(huán)境的培養(yǎng)條件、消除異種蛋白的影響，后來(lái)又發(fā)展了無(wú)飼養(yǎng)層、無(wú)血清的角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)法。本節(jié)將分別介紹以小鼠3T3細(xì)胞作為飼養(yǎng)層的角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)方法和無(wú)飼養(yǎng)層、無(wú)血清的角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)法。

一、角質(zhì)形成細(xì)胞的飼養(yǎng)層培養(yǎng)法

（一）材料

1．飼養(yǎng)層細(xì)胞　為來(lái)源于瑞士小鼠胚胎瘤的成纖維細(xì)胞系3T3細(xì)胞。在表皮細(xì)胞培養(yǎng)中常規(guī)用照射處理過(guò)的3T3細(xì)胞作飼養(yǎng)層，3T3細(xì)胞一般應(yīng)維持在低密度條件下培養(yǎng)。

2．皮膚來(lái)源　一般采用外科手術(shù)切除下的包皮、乳房或腹部皮膚，新生兒、小兒包皮最好。

3．培養(yǎng)液

（1）3T3細(xì)胞培養(yǎng)液：DMEM培養(yǎng)基，添加10%胎牛血清、4mmol／L谷氨酰胺以及100U／ml青霉素和100μg／ml鏈霉素。

（2）皮膚標(biāo)本儲(chǔ)運(yùn)液：DMEM培養(yǎng)基，添加10%胎牛血清、100U／ml青霉素、100μg／ml鏈霉素、2．5μg／ml兩性霉素和50μg／ml慶大霉素。

（3）角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)液：為DMEM與F12的混合培養(yǎng)基，按3∶1（V／V）比例混合，添加10%胎牛血清、4mmol／L谷氨酰胺、100U／ml青霉素、100μg／ml鏈霉素、0．4μg／ml氫化可的松、10－10　M霍亂毒素、5μg／ml轉(zhuǎn)鐵蛋白、2×10－11　M三碘甲腺原氨酸、1．8×10－4　M腺嘌呤、5μg／ml胰島素和10ng／ml表皮生長(zhǎng)因子。DMEM與F12的基礎(chǔ)培養(yǎng)基4℃保存，添加劑以濃縮液的形式－20℃保存，新鮮配用，一般不超過(guò)2周。

4．其他培養(yǎng)用液

（1）PBS液：無(wú)鈣鎂磷酸鹽緩沖液，成分為1%（W／V）NaCl，0．025%KCl，0．144% Na2HPO4，0．025%KH2PO4，調(diào)整溶液的pH為7．2，高溫、高壓消毒滅菌，室溫下儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

（2）胰蛋白酶－EDTA消化液：將0．25%的胰蛋白酶溶液和0．02%的EDTA溶液按1∶4（V／V）的比例配制。

（3）絲裂霉素C：濃度為400μg／ml，溶于培養(yǎng)用雙蒸水中，4℃避光保存。

（4）中性蛋白酶（dispase）液：用3T3細(xì)胞培養(yǎng)基配制，濃度為2mg／ml，過(guò)濾消毒，即配即用。

5．培養(yǎng)器皿　培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿和各種手術(shù)用刀、剪等。

（二）3T3細(xì)胞的傳代培養(yǎng)

當(dāng)3T3細(xì)胞生長(zhǎng)接近融合時(shí)，作傳代培養(yǎng)。步驟如下。

1．棄去培養(yǎng)液，用PBS平衡鹽溶液沖洗2次。

2．加入胰蛋白酶－EDTA消化液，在37℃孵育5min，或倒置顯微鏡下觀察到細(xì)胞收縮變圓為止。

3．加入含血清的培養(yǎng)液終止消化，用吸管輕輕吹打、分散細(xì)胞。

4．用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)算細(xì)胞的數(shù)量，然后離心（1　500r／min，5min）。

5．按3×10－3個(gè)／cm2的細(xì)胞密度種植于培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿中。注意細(xì)胞種植密度的高低可根據(jù)細(xì)胞融合的時(shí)間來(lái)確定。

6．細(xì)胞3～5d內(nèi)發(fā)生融合。在3T3細(xì)胞接近融合時(shí)再次重復(fù)上述步驟進(jìn)行細(xì)胞傳代培養(yǎng)。

（三）飼養(yǎng)層細(xì)胞的制備

1．選擇處于指數(shù)生長(zhǎng)期的3T3細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)接近50%融合時(shí)即更換培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24h。

2．在培養(yǎng)液中加入1～10μg的絲裂霉素C，再培養(yǎng)12h。

3．用培養(yǎng)液沖洗3次，最后一次于37℃再孵育10～20min。

4．按常規(guī)方法用胰蛋白酶消化收集3T3細(xì)胞，以2．5×104個(gè)／cm2的密度種植在培養(yǎng)瓶中，加入角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)液，液量為1ml／5cm2。

5．在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)大約12h，細(xì)胞貼壁、鋪展后，再種植角質(zhì)形成細(xì)胞。

（四）角質(zhì)形成細(xì)胞的原代培養(yǎng)

1．將外科手術(shù)切除下的皮膚置入皮膚標(biāo)本轉(zhuǎn)運(yùn)液中。

2．在超凈工作臺(tái)內(nèi)取出標(biāo)本，在75%乙醇中快速浸洗3次。

3．用剪刀仔細(xì)剪去皮下脂肪組織及部分真皮，并修剪成寬2～3mm的條狀。

4．用PBS漂洗2次，表皮面朝下浸于中性蛋白酶（Dispase）液中4℃過(guò)夜或37℃下消化2～4h。

5．從中性蛋白酶消化液中取出皮膚條，將其放入另一培養(yǎng)皿中，用兩把眼科鑷子將表皮與真皮分離開(kāi)。撕下的表皮薄而半透明，真皮結(jié)締組織由于吸收了水分而呈輕微腫脹的凝膠狀。如果不易分離，則須進(jìn)一步在中性蛋白酶消化液中繼續(xù)孵育。一般4℃下過(guò)夜消化較少出現(xiàn)此類(lèi)情況。

6．將分離的表皮條用胰蛋白酶溶液5ml，繼續(xù)振蕩消化5～10min，再加入5ml含10%胎牛血清DMEM終止消化。

7．經(jīng)150目不銹鋼濾網(wǎng)過(guò)濾，以1　500r／min離心10min，棄去上清，加入角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)液10ml，混勻，苔盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)。以（2～5）×104個(gè)細(xì)胞／cm2的密度種植于飼養(yǎng)層細(xì)胞表面。

（五）角質(zhì)形成細(xì)胞的維護(hù)與傳代培養(yǎng)

1．每周常規(guī)更換培養(yǎng)液2次。

2．隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，部分飼養(yǎng)層細(xì)胞開(kāi)始死亡和脫落，這時(shí)常常需要添加新的飼養(yǎng)層細(xì)胞。

3．原代角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)10～14d后開(kāi)始融合。當(dāng)生長(zhǎng)的細(xì)胞覆蓋了培養(yǎng)瓶底的70%～80%的面積時(shí)，開(kāi)始進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

4．細(xì)胞傳代用胰蛋白酶溶液消化傳代。胰蛋白酶的消化時(shí)間為10～15min，并需振蕩以使細(xì)胞脫壁。

5．細(xì)胞計(jì)數(shù)后，以（0．5～5）×104個(gè)細(xì)胞／cm2的密度種植在新的飼養(yǎng)層細(xì)胞上，也可以根據(jù)需要融合時(shí)間來(lái)決定細(xì)胞種植密度。生長(zhǎng)良好的第二代角質(zhì)形成細(xì)胞一般在7～10d內(nèi)融合。

二、角質(zhì)形成細(xì)胞的無(wú)血清、無(wú)飼養(yǎng)層培養(yǎng)

（一）材料

1．皮膚來(lái)源　同上。

2．培養(yǎng)液　角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)基（GIBCO，USA），2～8℃保存；使用時(shí)添加50μg／ml牛垂體提取物（BPE）50μg／ml，人重組表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（rEGF）5ng／ml，添加劑于－5～－20℃冷凍保存。

3．其他培養(yǎng)用液（GIBCO，USA）

（1）0．05%胰蛋白酶－0．53mM　EDTA： 0．05%胰蛋白酶與0．53mmol／L　EDTA· 4Na溶液1∶1（V／V）等量混合消化液。

（2）大豆胰酶抑制劑：濃度為10mg／ml，溶解于無(wú)鈣、鎂PBS緩沖鹽溶液中，過(guò)濾消毒，－20℃冷凍保存。

（3）中性蛋白酶（dispaseⅡ）：濃度為5mg／ml，溶解于無(wú)鈣、鎂PBS緩沖鹽溶液中，過(guò)濾消毒，－20℃冷凍保存。

（4）Versene：Versene為0．53mmol／L EDTA·4Na溶液的商品名，按0．2g／L的濃度溶于無(wú)鈣鎂PBS緩沖鹽溶液中，過(guò)濾消毒，2～8℃保存。

4．培養(yǎng)器皿　培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿和各種手術(shù)用刀、剪等。

（二）表皮角質(zhì)形成細(xì)胞的分離與原代培養(yǎng)

1．手術(shù)切除的皮膚標(biāo)本置入含有慶大霉素（濃度為5μg／ml）的角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)液中。

2．在超凈工作臺(tái)內(nèi)取出皮膚標(biāo)本，用含有慶大霉素（濃度為20μg／ml）的無(wú)鈣、鎂PBS緩沖鹽溶液沖洗。

3．用剪刀仔細(xì)剪去皮下脂肪組織及部分真皮，并修剪成寬2～3mm的條狀，用無(wú)鈣鎂PBS漂洗2次，表皮面朝上浸于0．5%中性蛋白酶中消化4℃下18h。

4．18h后，用兩把眼科鑷子將表皮從真皮上撕下，剪成碎片，再用0．05%胰蛋白酶－0．53mmol／L　EDTA在37℃消化15min，10ml大豆胰酶抑制劑終止消化。

5．經(jīng)150目不銹鋼濾網(wǎng)過(guò)濾，以1　500r／min離心10min，棄去上清，加入角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)液10ml，混勻，苔盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)。

6．按3×106／75cm2密度接種培養(yǎng)，加入角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)基（5ml／25cm2）在37℃，5%CO2，100%相對(duì)濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)液3d換1次。一般原代培養(yǎng)7～10d接近融合。

（三）表皮角質(zhì)形成細(xì)胞的傳代培養(yǎng)

1．當(dāng)細(xì)胞融合到60%～75%密度時(shí)，吸出培養(yǎng)液，用10ml無(wú)鈣鎂PBS沖洗。

2．經(jīng)0．05%胰酶0．53mmol／L　EDTA 37℃消化5～10min，當(dāng)在倒置顯微鏡下觀察到90%的細(xì)胞收縮變圓時(shí)，加入10ml胰酶抑制劑終止消化，輕輕吹打。

3．將細(xì)胞懸液移入離心管中，1　500r／min離心10min。

4．棄去上清液，加入角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)液10ml，混勻，計(jì)數(shù)，按1∶3的比例傳代培養(yǎng)。

5．2～3d換1次培養(yǎng)液，直到細(xì)胞融合至60%～75%密度時(shí)，再傳代培養(yǎng)。

三、表皮角質(zhì)形成細(xì)胞的生長(zhǎng)

生物學(xué)特點(diǎn)

體外培養(yǎng)表皮角質(zhì)形成細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)與體內(nèi)有很大的相似性，表皮角質(zhì)形成細(xì)胞的形態(tài)和一些特殊結(jié)構(gòu)可以重現(xiàn)。但由于體內(nèi)、外生長(zhǎng)環(huán)境的不同，細(xì)胞分化的特性和程度不一，體外培養(yǎng)表皮角質(zhì)形成細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)和體內(nèi)細(xì)胞仍然有一定差異。

用一般光學(xué)顯微鏡觀察體外培養(yǎng)的角質(zhì)形成細(xì)胞，在構(gòu)造和生物學(xué)形狀上與體內(nèi)細(xì)胞有著極大的相似性。體外培養(yǎng)的表皮角質(zhì)形成細(xì)胞呈多角形，常呈集落式生長(zhǎng)，鑲嵌排列，融合后呈現(xiàn)典型的“鋪路石樣”。細(xì)胞的均質(zhì)性和透明性很強(qiáng)，結(jié)構(gòu)不明顯。用相差顯微鏡能看清楚細(xì)胞的輪廓和內(nèi)部結(jié)構(gòu)，而細(xì)胞中的細(xì)胞器等結(jié)構(gòu)需結(jié)合固定染色或特殊技術(shù)才能顯示。此外，細(xì)胞的形態(tài)特征與培養(yǎng)液中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的多少有關(guān)，當(dāng)培養(yǎng)液中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被耗竭導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)不佳時(shí)，細(xì)胞輪廓增強(qiáng)，反差增大，且胞質(zhì)中出現(xiàn)顆粒、脂滴和空泡等，出現(xiàn)細(xì)胞代謝不良等形態(tài)表現(xiàn)。如果細(xì)胞傳代次數(shù)再增加或在體外生活時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞形狀會(huì)更加不規(guī)則，甚至出現(xiàn)雙核或多核的現(xiàn)象，細(xì)胞的貼壁能力也大大降低（圖4－13，彩圖14）。

圖4－13　表皮角質(zhì)形成細(xì)胞原代接種后7～10d，細(xì)胞呈鑲嵌狀緊密排列，單個(gè)細(xì)胞為多角形，融合后呈現(xiàn)“鋪路石樣”（倒置相差顯微鏡，×100）

電鏡下觀察體外培養(yǎng)的表皮角質(zhì)形成細(xì)胞，表面可見(jiàn)許多微絨毛。在融合后的角質(zhì)形成細(xì)胞相鄰面，常常形成特殊的細(xì)胞間連接——橋粒（圖4－14）。體外培養(yǎng)角質(zhì)形成細(xì)胞核的超微結(jié)構(gòu)與體內(nèi)細(xì)胞并無(wú)多大區(qū)別，細(xì)胞核圓形或卵圓形，位于中央。各種細(xì)胞器的形態(tài)結(jié)構(gòu)與體內(nèi)細(xì)胞相似，但隨著體外培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞器的結(jié)構(gòu)和數(shù)量會(huì)發(fā)生一定改變。此外，電鏡下觀察體外培養(yǎng)的角質(zhì)形成細(xì)胞，其胞質(zhì)內(nèi)還可以見(jiàn)到一些特征性的細(xì)胞器或包含物，如角蛋白顆粒、張力細(xì)絲等（圖4－15）。

圖4－14　掃描電鏡觀察：表面角質(zhì)形成細(xì)胞鑲嵌狀排列，表面可見(jiàn)許多微絨毛（×800）

圖4－15　培養(yǎng)細(xì)胞透射電鏡照片：細(xì)胞器正常，胞質(zhì)內(nèi)分布有大量角蛋白顆粒和成束排列的張力絲（×9　700）

四、討　　論

1．皮膚的取材和無(wú)菌處理　皮膚與外界環(huán)境直接接觸，都存在著不同程度的細(xì)菌等微生物的污染，盡管在外科手術(shù)時(shí)已采取了較嚴(yán)格的消毒措施，但用于細(xì)胞培養(yǎng)的標(biāo)本仍需作進(jìn)一步的處理。乙醇浸洗對(duì)取材后皮膚的消毒滅菌十分重要，在汗腺、皮脂腺孔周?chē)奈⑸锝?jīng)過(guò)乙醇消毒一般都可以殺滅去除。多數(shù)情況下，皮膚標(biāo)本還需經(jīng)過(guò)含有較高濃度抗生素的緩沖液漂洗數(shù)次。皮膚材料需盡可能新鮮，取材后應(yīng)立即進(jìn)行細(xì)胞分離培養(yǎng)，否則，要將皮膚置于皮膚標(biāo)本儲(chǔ)運(yùn)液中2～8℃下保存，有文獻(xiàn)報(bào)道最多可以保存5d，并且仍能維持較好的細(xì)胞活力。在皮膚材料來(lái)源上，材料來(lái)源的個(gè)體越年輕，角質(zhì)形成細(xì)胞的生長(zhǎng)潛能越大。一般來(lái)說(shuō)，用于培養(yǎng)的皮膚材料應(yīng)盡可能來(lái)源于年輕個(gè)體，以年齡小于16歲為好，不要超過(guò)60歲。

2．關(guān)于3T3飼養(yǎng)層細(xì)胞的維護(hù)　3T3細(xì)胞在培養(yǎng)過(guò)程中，要注意以下幾個(gè)問(wèn)題：①首要的是防止3T3細(xì)胞過(guò)度融合，以免造成3T3細(xì)胞對(duì)絲裂霉素C或?qū)ι渚€處理的抗性，而使3T3細(xì)胞保持了活躍的增殖能力干擾了角質(zhì)形成細(xì)胞的生長(zhǎng)。②在用絲裂霉素C或γ射線照射處理3T3細(xì)胞時(shí)，其作用劑量都應(yīng)進(jìn)行滴定或測(cè)試。經(jīng)過(guò)處理的作為角質(zhì)形成細(xì)胞飼養(yǎng)層的3T3細(xì)胞應(yīng)該是有活力貼壁鋪展，但不再具有分裂增殖的能力。③合適的3T3細(xì)胞種植密度對(duì)促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖與分化，以及抑制成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)相當(dāng)重要，應(yīng)該以能覆蓋培養(yǎng)面積的70%為宜。

3．在角質(zhì)形成細(xì)胞完全融合前進(jìn)行傳代培養(yǎng)相當(dāng)重要，否則，角質(zhì)形成細(xì)胞將形成復(fù)層而喪失通透性，使基底細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)缺乏，最終導(dǎo)致復(fù)層生長(zhǎng)的角質(zhì)形成細(xì)胞死亡或進(jìn)行分化。最適宜的傳代時(shí)間是當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至覆蓋培養(yǎng)面積的70%時(shí)。

（上海第二醫(yī)科大學(xué)第九人民醫(yī)院　崔　磊　楊光輝）

參　考　文　獻(xiàn)

1　成令忠主編 ．組織學(xué) ．北京：人民衛(wèi)生出版社，1994

2　鄂　征主編 ．組織培養(yǎng)和分子細(xì)胞學(xué)技術(shù) ．北京：北京出版社，1995

3　薛慶善主編 ．體外培養(yǎng)的原理與技術(shù) ．北京：科學(xué)出版社，2001

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5Rheinwald　JG，Green　H．Epidermal　growth　factor　and　the　multiplication　of　cultured　human　epidermal　keratinocytes．Nature，1977；265，421－424

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