子任務(wù)二　酶類自由基清除劑

一、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)

英國(guó)人Mann等人于1938年首次從小牛血液中分離出一種含銅的藍(lán)綠色蛋白質(zhì)，但沒(méi)有發(fā)現(xiàn)這種蛋白質(zhì)的生理活性。1969年Mccwrd及Fridovich發(fā)現(xiàn)了該酶的歧化反應(yīng)，并首次把這種酶蛋白命名為超氧化物歧化酶，英文簡(jiǎn)稱為SOD。

超氧化物歧化酶(SOD)是目前研究最深入、應(yīng)用最廣泛的一種酶類自由基清除劑，是一種能夠催化超氧化物通過(guò)歧化反應(yīng)轉(zhuǎn)化為氧氣和過(guò)氧化氫的酶。它廣泛存在于各類植物、動(dòng)物、微生物中，是一種重要的抗氧化劑，保護(hù)暴露于氧氣中的細(xì)胞。研究表明，SOD在生物界的分布極為廣泛，幾乎所有靠氧呼吸的生物體內(nèi)，包括細(xì)菌、真菌、高等植物、高等動(dòng)物和人體中都有它的存在。

(一)超氧化物歧化酶的分類及生理功能

1.超氧化物歧化酶的分類

SOD是一類含金屬的酶，按其所含金屬輔基的不同，可分為含銅鋅SOD(Cu·Zn－SOD)、含錳SOD(Mn－SOD)和含鐵SOD(Fe－SOD) 3種。

含銅鋅金屬輔基的Cu·Zn－SOD是一種最為常見(jiàn)的酶，呈藍(lán)綠色，主要存在于真核細(xì)胞質(zhì)和高等植物的葉綠體基質(zhì)及線粒體內(nèi)膜間隙中。在牛肝、豬肝、牛心、動(dòng)物血液及植物的葉、果實(shí)等動(dòng)植物組織中均有存在，是目前應(yīng)用最廣泛的一類酶。

Mn－SOD呈紫紅色，主要存在于真核細(xì)胞以及線粒體的基質(zhì)中，一些真核藻類甚至高等植物如銀杏、檸檬、番茄等組織內(nèi)也有存在。

Fe－SOD呈黃褐色，主要存在于原核細(xì)胞及少數(shù)高等植物中，在高等植物中一般僅存在于葉綠體而不存在于線粒體中。三種酶都可催化超氧陰離子(O^－2·)歧化生成H₂ O₂和O₂，但其性質(zhì)有所不同，其中Cu·Zn－SOD與其他兩種SOD差別較大，而Mn－SOD與Fe－SOD之間差別較小。

2.超氧化物歧化酶的主要理化特性

SOD屬酸性蛋白酶，對(duì)蛋白水解酶、pH和熱等較穩(wěn)定。SOD又屬于金屬酶，其性質(zhì)不僅取決于蛋白質(zhì)，還取決于結(jié)合到活性部位的金屬離子。SOD是生物體內(nèi)防御氧化損傷的一種十分重要的金屬酶，對(duì)氧自由基有強(qiáng)烈清除作用，特別對(duì)于超氧陰離子(O^－2·)，SOD可將其催化歧化而生成H₂O₂和O₂，故SOD又稱為清除超氧陰離子自由基的特異酶。

3.超氧化物歧化酶的生理功能

(1)延緩衰老

衰老自由基學(xué)說(shuō)認(rèn)為衰老是來(lái)自機(jī)體正常代謝過(guò)程中產(chǎn)生過(guò)量的自由基對(duì)機(jī)體損害的結(jié)果。當(dāng)機(jī)體衰老時(shí)，體內(nèi)各式各樣的自由基生成增多，自由基作為人體垃圾，是人體重要的內(nèi)毒素之一。由于超氧化物歧化酶能夠清除自由基，因而具有延緩衰老的作用。

(2)治療自身免疫性疾病

超氧化物歧化酶對(duì)各類自身免疫性疾病都有一定的療效，如紅斑狼瘡、關(guān)節(jié)炎、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、老年退化性疾病等，都有較好的療效。

(3)與放射治療結(jié)合治療癌癥

超氧化物歧化酶還可以用來(lái)治療由于放射治療和放射事故引起的放射病和放射損傷。放射治療既能殺死癌細(xì)胞，又會(huì)殺死正常組織細(xì)胞，如果在放射治療時(shí)提高正常組織中的SOD含量以清除放射線誘發(fā)產(chǎn)生的大量的O^－2·，就可有效地抑制放射線對(duì)正常組織的損傷。

(4)消除肌肉疲勞

在軍事、體育和救災(zāi)等超負(fù)荷大量運(yùn)動(dòng)量過(guò)程中，機(jī)體中部分組織細(xì)胞(特別是肌肉部位)會(huì)出現(xiàn)暫時(shí)性缺血及重灌流現(xiàn)象，引起缺血后重灌流損傷，加上大量乳酸的作用，導(dǎo)致了肌肉的疲勞與損傷。這時(shí)，給肌肉注射SOD可有效地解除疲勞與損傷。若在運(yùn)動(dòng)前給予SOD，則可保護(hù)肌肉，避免出現(xiàn)疲勞和損傷。

(5)提高人體的抵抗力

SOD能提高人體的抵抗力，包括提高人體對(duì)自由基侵害而誘發(fā)疾病的抵抗力，如對(duì)炎癥、肺氣腫、白內(nèi)障、自身免疫性疾病、腫瘤等疾病的抵抗力。同時(shí)，SOD能提高人體對(duì)自由基誘發(fā)因子損害的抵抗力，如煙霧、輻射、有毒化學(xué)藥品和有毒醫(yī)藥等的損害，增強(qiáng)機(jī)體對(duì)外界環(huán)境的適應(yīng)力。

(二)超氧化物歧化酶的制備工藝

超氧化物歧化酶的制備工藝是依據(jù)酶蛋白質(zhì)的性質(zhì)而設(shè)計(jì)的，其方法也是常用的蛋白質(zhì)分離方法，如熱變性法、等電點(diǎn)沉淀法、鹽析法、有機(jī)溶劑沉淀法、超濾法、層析法等，或者幾種方法的結(jié)合使用。

1.制備超氧化物歧化酶的原料

制備超氧化物歧化酶的原料很多，主要有以下幾類:

(1)動(dòng)物主要有牛血、豬血、馬血、鴨血、豬肝、牛乳、蛋黃等。

(2)植物包括刺梨、大蒜、冬菇、玉米、白菜、大豆、花生等。

(3)微生物如酵母菌等。

2.有機(jī)溶劑沉淀法制備超氧化物歧化酶

(1)原理

向蛋白質(zhì)溶液中加入弱極性的有機(jī)溶劑如丙酮，可改變?nèi)芤旱慕殡姵?shù)，使不同種類蛋白質(zhì)的溶解度產(chǎn)生不同程度降低，還可進(jìn)行蛋白質(zhì)的純化。當(dāng)丙酮加入量達(dá)到1.0(V/V)時(shí)，SOD比活最高，再加入丙酮將導(dǎo)致SOD活力急劇下降。

(2)材料、試劑與儀器

材料、試劑:大蒜、磷酸氫二鉀、硫酸銅、酒石酸鉀鈉、丙酮、標(biāo)準(zhǔn)蛋白(牛血清蛋白)。

儀器:恒溫水浴鍋、pH數(shù)字酸度計(jì)、高速冷凍離心機(jī)、冰箱、透析袋、冷凍干燥機(jī)等。

(3)工藝流程

對(duì)于不同原料，SOD的提取工藝也有所不同，其基本工藝流程如下:

(4)工藝要點(diǎn)

①SOD粗浸提:將大蒜研磨成蒜泥，加入3倍體積(mL/mg)的磷酸緩沖液，浸泡30～45min，用6層紗布抽濾，反復(fù)共3次，收集3次抽濾所得濾液，測(cè)得粗酶液。

②熱變性:粗酶液在60℃的恒溫水浴鍋中保持20min進(jìn)行熱變性。

③高速冷凍離心:離心是在4℃、12 000rpm的條件下進(jìn)行。

④調(diào)整pH、高速冷凍離心:用磷酸調(diào)整溶液的pH至3.5，然后在4℃、12 000rpm的條件下離心。

⑤丙酮沉淀、離心:在離心液中加入丙酮的量為1.0 v/v，4℃、12 000rpm離心，去除大部分雜蛋白。

⑥溶解沉淀、透析、冷凍干燥:在所得上清液中加入1.2～1.4 v/v的丙酮使SOD全部沉淀下來(lái);將沉淀溶解在少量的緩沖液中，在4℃環(huán)境中透析10h。將透析過(guò)的樣品進(jìn)行冷凍干燥，即得成品。

大蒜中SOD的含量比其他植物相對(duì)較高，從大蒜中提取SOD，成本低廉。

3.鹽析法制備超氧化物歧化酶

(1)原理

當(dāng)溶液中鹽濃度增高到一定數(shù)值時(shí)，使水活度降低，導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子表面電荷逐漸被中和，水化膜逐漸被破壞，最終引起蛋白質(zhì)分子間相互聚集并從溶液中析出。硫酸銨因價(jià)廉、溶解度大，且能使蛋白質(zhì)的性質(zhì)保持穩(wěn)定而成為最常用的鹽析劑。選擇一定濃度范圍的鹽濃度(如1%～25%飽和度硫酸銨)，使部分雜質(zhì)呈“鹽析”(沉淀)狀態(tài)，有效成分呈“鹽溶”(溶解)狀態(tài)。經(jīng)離心分離后得到上清液，再選擇一定濃度范圍的鹽濃度(如25%～60%飽和度的鹽溶液)，使SOD呈鹽析狀態(tài)，而另一部分雜質(zhì)呈鹽溶狀態(tài)，用離心法收集的沉淀即為初步分離制備的SOD。

(2)原料、試劑、儀器

大蒜;殼聚糖螯合吸附劑、硫酸銨等;自動(dòng)平衡記錄儀、高速冷凍離心機(jī)、層析柱等。

(3)工藝流程

(4)工藝要點(diǎn)

①粗酶液浸提:將大蒜與pH7.8磷酸鉀緩沖液按重量體積比為1∶1.5添加，組織搗碎，在4℃環(huán)境中浸提3h，四層紗布過(guò)濾，即得粗酶液。

②兩次鹽析:粗酶液加硫酸銨至55%飽和度，4℃環(huán)境中靜置過(guò)夜，12 000rpm分離心20min，上清液加硫酸銨固體粉末至95%的飽和度，靜置3h后離心20min，取沉淀備用。

③親和層析柱的制備:取以殼聚糖為基質(zhì)合成的螯合吸附劑裝柱，用濃度為0.1mol/L CuSO₄灌柱至飽和。螯合柱用pH 7.8含0.5mol/L NaCl的0.05mol/L的磷酸鈉緩沖液進(jìn)行平衡后備用。親和層析:取樣品上柱，以含0.5mol/L NaCl和0.05mol/L磷酸鈉緩沖液進(jìn)行洗脫，控制流速為1.0mL/min.每3min為一管，并以核酸蛋白檢測(cè)儀進(jìn)行監(jiān)測(cè)，收集活性部分。

④透析和冷凍干燥:將活性部分在4℃環(huán)境中透析12～24h，冷凍干燥即得成品。

硫酸銨分級(jí)鹽析法的優(yōu)點(diǎn)是方便易行，常溫下也不易導(dǎo)致酶失活，純化效果好，與有機(jī)溶劑分級(jí)沉淀法相比更有利于保持蛋白質(zhì)的生理活性，但分辨率不及有機(jī)溶劑分級(jí)沉淀法。

(三)超氧化物歧化酶的修飾工藝

超氧化物歧化酶在體內(nèi)半衰期短，穩(wěn)定性差，具有異源蛋白免疫源性和細(xì)胞膜的通透性差等缺點(diǎn)。為克服SOD的這些缺點(diǎn)，提高超氧化物歧化酶的穩(wěn)定性，有必要對(duì)超氧化物歧化酶分子進(jìn)行必要的修飾改造。

目前對(duì)SOD分子進(jìn)行分子修飾改造的途徑有:①對(duì)SOD氨基酸殘基進(jìn)行化學(xué)修飾;②用水溶性大分子對(duì)SOD氨基酸進(jìn)行共價(jià)修飾;③對(duì)SOD進(jìn)行酶切修飾。常用的修飾劑有聚乙二醇、硬脂酸、葡萄糖酸內(nèi)酯、月桂酸、右旋糖酐等。修飾酶不僅完全保留了天然酶的活性，較天然酶穩(wěn)定，而且在耐熱、耐酸、耐堿和抗胃蛋白酶水解能力等方面明顯優(yōu)于天然酶。

1.聚乙二醇(PEG)修飾法

(1)原理

聚乙二醇(PEG)分子末端有兩個(gè)能被活化的羥基，可以與許多種類的活化劑起反應(yīng)而被激活，然后再與SOD分子表面賴氨酸殘基上的ε－氨基進(jìn)行修飾，增強(qiáng)了SOD對(duì)環(huán)境的穩(wěn)定性。

(2)試劑與設(shè)備

聚乙二醇、三聚氰氯、四硼酸鈉、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀等;真空干燥器、冷凍干燥機(jī)等。

(3)工藝流程

(4)工藝要點(diǎn)

①聚乙二醇活化:三聚氰氯使用前用新鮮蒸餾過(guò)的無(wú)水苯重結(jié)晶兩次。取5.5g三聚氰氯、10g無(wú)水碳酸鈉及40g聚乙二醇，加入400mL無(wú)水苯中，常溫下攪拌過(guò)夜，過(guò)濾。用乙醚沉淀出產(chǎn)物，再用苯溶液沉淀。如此沉淀、溶解反復(fù)多次，直至紫外檢測(cè)無(wú)三聚氰氯吸收。真空干燥，得白色固態(tài)粉末，在冰箱中密封保存。

②PEG修飾SOD: 10mgSOD加入0.65g活化聚乙二醇，在pH 9.2的四硼酸鈉溶液中反應(yīng)1h。

③冷凍干燥:產(chǎn)物在pH為7.3的磷酸緩沖液透析2h，冷凍干燥得白色粉末狀的PEG－SOD聚合物。

聚乙二醇(PEG)有一系列不同相對(duì)分子質(zhì)量的產(chǎn)品，無(wú)毒，無(wú)免疫原性，是最為常用的修飾劑。

2.月桂酸修飾法

(1)原理

以月桂酸修飾劑，對(duì)SOD分子表面賴氨酸進(jìn)行修飾，提高了穩(wěn)定性。

(2)試劑、儀器

月桂酸、牛血、氯化亞砜、砒碇DMF、Sephadex G－100;分光光度計(jì)、中空纖維透析器、高速冷凍離心機(jī)、減壓蒸餾裝置、冷凍干燥機(jī)等。

(3)工藝流程

(4)工藝要點(diǎn)

①月桂酸活化:將月桂酸與氯化亞砜在90℃～95℃攪拌反應(yīng)2h，回流2h，加入砒碇DMF催化分應(yīng)，將反應(yīng)物進(jìn)行分餾、減壓，收集146℃～150℃的餾分，此即活化的月桂酸。

②SOD修飾:將SOD溶于弱堿性PBS緩沖液，加入活化的月桂酸，40℃下攪拌1h后冷卻至室溫。

③丙酮沉淀:加入丙酮，離心取沉淀，將沉淀用蒸餾水洗滌數(shù)次，除去丙酮。

④冷凍干燥:收集酶活性部分，透析、超濾、冷凍干燥即得月桂酸修飾的SOD。

(四)氧化物歧化酶在食品工業(yè)中的應(yīng)用

SOD的應(yīng)用價(jià)值很高，已廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)藥、日用美容化妝品的生產(chǎn)中，在功能食品中的應(yīng)用也極為廣泛。

隨著SOD資源的開(kāi)發(fā)和制備技術(shù)的改良，SOD作為一種抗炎、抗衰老、抗腫瘤、增強(qiáng)免疫的功能性因子，在食品工業(yè)中擁有廣泛的應(yīng)用前景。

1. SOD食品營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑

國(guó)外把SOD作為食品添加劑應(yīng)用到口香糖和飲料中。國(guó)內(nèi)也開(kāi)發(fā)出了多種強(qiáng)化SOD的食品，如SOD果汁飲料、SOD的酸奶、SOD雪糕、SOD豆奶、SOD啤酒、SOD冷飲、SOD牛奶、SOD保健酒等類型的功能食品相繼面世。這類功能食品具有良好的抗衰老、抗炎、抗輻射、抗疲勞等保健強(qiáng)身的效果。

2. SOD食品抗氧化劑

超氧物歧化酶是一種天然抗氧化劑。目前超氧物歧化酶已被申請(qǐng)作為食品抗氧化劑的專利產(chǎn)品。SOD與其他抗氧化劑一樣，添加到罐頭食品、果汁、啤酒等，以防止過(guò)氧化酶引起的食品變質(zhì)及腐敗現(xiàn)象。SOD還可作為水果、蔬菜良好的保鮮劑。

3. SOD抗衰老保健品

現(xiàn)在已經(jīng)有SOD膠囊、膠丸、含片、口服液、顆粒劑等形式的SOD抗衰老保健品，市場(chǎng)前景較好。

4. SOD功能性食品

以富含SOD的原料開(kāi)發(fā)了天然功能性食品，比較典型的有大蒜汁、刺梨汁、蘆薈汁、菠蘿汁等。其中大蒜是SOD含量較高的天然植物之一，利用大蒜組織培養(yǎng)生產(chǎn)富含SOD的功能性食品，具有成本低，實(shí)用性強(qiáng)，易實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)的特點(diǎn)。

在某些發(fā)達(dá)國(guó)家和地區(qū)，如日本有SOD糖出售，我國(guó)也有SOD泡泡糖、SOD功能飲料、SOD強(qiáng)化牛奶等產(chǎn)品的研制，SOD保健品(制劑或強(qiáng)化食品)已被消費(fèi)者廣泛接受。但SOD的制備提純工藝復(fù)雜，成本高，其在食品中的大量應(yīng)用仍有一定限制。隨著新的SOD來(lái)源的開(kāi)發(fā)和制備技術(shù)的改良，SOD作為一種高效、安全的功能因子，在食品工業(yè)中擁有廣泛的市場(chǎng)市場(chǎng)前景。

二、過(guò)氧化氫酶(catalase，CAT)

過(guò)氧化氫酶是泰納爾(Louis Jacques Thénard)于1811年被首次發(fā)現(xiàn)，并且泰納爾已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了過(guò)氧化氫(H₂O₂)。1900年，Oscar Loew將這種能夠降解過(guò)氧化氫的酶命名為“catalase”，即過(guò)氧化氫酶，并發(fā)現(xiàn)這種酶存在于許多植物和動(dòng)物中。

過(guò)氧化氫酶，又稱為觸酶，主要分布在于紅細(xì)胞及某些細(xì)胞內(nèi)微粒體中，它的主要作用就是催化H₂O₂分解為H₂O與O₂，不至于使H₂O₂與O₂在鐵螯合物作用下反應(yīng)生成毒性更強(qiáng)的OH^－，使細(xì)胞免于遭受H₂O₂的毒害。過(guò)氧化氫酶是生物防御體系的關(guān)鍵酶之一。

CAT作用于過(guò)氧化氫的機(jī)理實(shí)質(zhì)上是H₂ O₂的歧化，有兩個(gè)H₂O₂先后與CAT相遇且碰撞在活性中心上，發(fā)生反應(yīng)。H₂O₂濃度越高，分解速度越快。

過(guò)氧化氫酶幾乎存在于所有的生物機(jī)體中，普遍存在于能呼吸的生物體內(nèi)，主要存在于植物的葉綠體、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、動(dòng)物的肝和紅細(xì)胞中，其酶促活性為機(jī)體提供了抗氧化防御機(jī)理。

三、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH－Px)

谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH－Px)由Mills于1957年從牛紅細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，是在哺乳動(dòng)物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)含硒酶，故又名硒谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(Se－GSH－Px)，它是體內(nèi)清除H₂O₂和許多有機(jī)氫過(guò)氧化物的重要酶。

GSH－Px的活性中心是硒半胱氨酸，其活力大小可以反映機(jī)體硒水平。GSH－Px是機(jī)體內(nèi)廣泛存在的一種重要的過(guò)氧化物分解酶。Se－GPX存在于胞漿和線粒體基質(zhì)中，以谷胱甘肽(GSH)為還原劑分解體內(nèi)的氫過(guò)氧化物，能使有毒的過(guò)氧化物還原成無(wú)毒的羥基化合物，并使過(guò)氧化氫分解成醇和水，因而可防止細(xì)胞膜和其他生物組織免受過(guò)氧化損傷。它同體內(nèi)的超氧化物歧化酶(SOD)和過(guò)氧化氫酶(CAT)一起構(gòu)成了抗氧化防御體系，因而在機(jī)體抗氧化中發(fā)揮著重要作用。

機(jī)體在正常條件下，大部分活性氧被機(jī)體防御系統(tǒng)所清除，但當(dāng)機(jī)體產(chǎn)生某些病變時(shí)，超量的活性氧就會(huì)對(duì)細(xì)胞膜產(chǎn)生破壞。機(jī)體消除活性氧O^－2·的第一道防線是超氧化物歧化酶(SOD)，它將O^－2·轉(zhuǎn)化為過(guò)氧化氫和水，而第二道防線是過(guò)氧化氫酶(CAT)和GSH－Px。CAT可清除H₂ O₂，而GPX分布在細(xì)胞的胞液和線粒體中消除H₂O₂和氫過(guò)氧化物。因此，GSH－Px、SOD和CAT協(xié)同作用，共同消除機(jī)體活性氧，減輕和阻止脂質(zhì)過(guò)氧化作用。