第六節(jié)　其他血清學(xué)技術(shù)

一、病毒蝕斑技術(shù)

1952年，Dulbecco把噬菌體空斑技術(shù)應(yīng)用于動(dòng)物病毒學(xué)，從而使病毒蝕斑技術(shù)（Virusplaque formation）成為許多病毒的滴定和研究方法。

（一）原理

病毒感染細(xì)胞后，由于固體介質(zhì)的限制，釋放的病毒只能由最初感染的細(xì)胞向周邊擴(kuò)展。經(jīng)過(guò)幾個(gè)增殖周期，便形成一個(gè)局限性病變細(xì)胞區(qū)，此即病毒蝕斑。從理論上講，一個(gè)蝕斑是由最初感染細(xì)胞的一個(gè)病毒顆粒形成的，因而該項(xiàng)技術(shù)常用于病毒顆粒計(jì)數(shù)和分離病毒克隆。但在實(shí)際操作中，常出現(xiàn)幾個(gè)病毒顆粒同時(shí)感染一個(gè)細(xì)胞的情況，影響滴定的準(zhǔn)確性和克隆的純一性。為此，接種的病毒液要充分分散和稀釋。對(duì)于細(xì)胞結(jié)合性病毒，如MDV，需用單層細(xì)胞；對(duì)細(xì)胞釋放性病毒，即可用固相介質(zhì)懸浮的細(xì)胞，也可用單層細(xì)胞，但后者需用瓊脂等固體介質(zhì)蓋在細(xì)胞上，以防釋放的病毒在液體介質(zhì)中流動(dòng)。固體介質(zhì)的濃度由病毒的大小而定，大病毒用濃度較低的介質(zhì)，小病毒用濃度較高的介質(zhì)，以便將蝕斑的生長(zhǎng)速度控制在適宜的范圍內(nèi)。小蝕斑需用顯微鏡觀察，1～10mm的大蝕斑可用肉眼計(jì)數(shù)。為便于肉眼觀察，常用中性紅等染料染色。因病變細(xì)胞不吸收中性紅，病變細(xì)胞區(qū)便呈現(xiàn)無(wú)色蝕斑。病毒懸液的滴度以每毫升蝕斑形成單位（PFU/ml）來(lái)表示。

（二）技術(shù)

應(yīng)用蝕斑技術(shù)可以應(yīng)用于分離病毒的克?。o(wú)性繁殖純系）、病毒或血清的滴定，也可用蝕斑形態(tài)和大小研究病毒的生物學(xué)特性。

1.病毒生物學(xué)純化（virus biological purification）在進(jìn)行血清中和試驗(yàn)時(shí)，常常會(huì)出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)病毒株的滴度下降，因而影響了試驗(yàn)的準(zhǔn)確性，這種情況多見(jiàn)于蟲(chóng)媒病毒。這可能是由于原始毒種的混雜，或者已有許多變異病毒粒子存在其中，甚至出現(xiàn)數(shù)量眾多的缺陷病毒所致。這時(shí)，有必要把手上掌握的標(biāo)準(zhǔn)毒株進(jìn)行純化，應(yīng)用病毒蝕斑技術(shù)，挑選出各個(gè)不同的純化病毒，亦稱(chēng)“克隆株”?？寺『蟮牟《窘?jīng)在敏感細(xì)胞上增殖，測(cè)定其滴度，選用合適的毒株用于血清中和試驗(yàn)。為了更有效地進(jìn)行純化，必須在覆蓋營(yíng)養(yǎng)瓊脂之前用營(yíng)養(yǎng)液洗去單層細(xì)胞上未被吸附的病毒。同時(shí)要控制好稀釋的濃度，一個(gè)培養(yǎng)瓶中的蝕斑數(shù)目最好不超過(guò)10個(gè)，挑取在其附近10mm都是健康細(xì)胞的蝕斑。挑取后的病毒應(yīng)傳兩代或兩代以上。一般認(rèn)為，中性紅染料會(huì)由于“光敏”作用而抑制病毒蝕斑的形成和破壞宿主細(xì)胞。因此，加了中性紅覆蓋層的培養(yǎng)物應(yīng)在暗處培養(yǎng)。

2.蝕斑減少中和試驗(yàn)（plaque reduction neutralization test）蝕斑減少中和試驗(yàn)是檢測(cè)血清中和抗體的一種敏感性較高的方法。試驗(yàn)以使蝕斑數(shù)減少50%的血清稀釋度作為其中的效價(jià)。試驗(yàn)使用定量的病毒（100PFU）與不同稀釋度的等量血清混合后感作，接種預(yù)先準(zhǔn)備好的單層細(xì)胞，再覆蓋營(yíng)養(yǎng)瓊脂置37℃二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)，數(shù)天后分別統(tǒng)計(jì)蝕斑數(shù)，用Karber法計(jì)算該血清的蝕斑中和效價(jià)。其操作原理與傳統(tǒng)的血清中和試驗(yàn)大致相同。

由于本試驗(yàn)的操作比較繁瑣，目前在國(guó)內(nèi)極少應(yīng)用，國(guó)際上也沒(méi)有把它作為一種各國(guó)都接受的診斷方法，僅在OIE國(guó)際動(dòng)物衛(wèi)生法典（第六版）中列為對(duì)裂谷熱的規(guī)定診斷方法之一。

3.操作步驟

（1）病毒的滴定或純化

①在滅菌的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)合適的細(xì)胞，使形成單層。細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間為3～4天，接種量約為200萬(wàn)個(gè)細(xì)胞/ml。選取單層細(xì)胞全部覆蓋，不留有空洞的培養(yǎng)皿用做試驗(yàn)。

②用細(xì)胞培養(yǎng)液對(duì)病毒作10倍倍比稀釋至10^－7并保存于4℃。

③每個(gè)稀釋度的病毒液接種3個(gè)平皿。

④接種前棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，用5ml PBS或細(xì)胞培養(yǎng)液沖洗單層細(xì)胞，然后棄去沖洗液。

⑤每個(gè)平皿分別加入0.2ml病毒稀釋液，對(duì)照組只用細(xì)胞培養(yǎng)液代替，置37℃二氧化碳培養(yǎng)箱吸附1h，每15min搖動(dòng)一次，以便使病毒均勻分布。

⑥按步驟④沖洗未被吸附的病毒。

⑦取2倍濃縮的細(xì)胞培養(yǎng)液加入等量的1.6%瓊脂（預(yù)熱）中，每個(gè)平皿加入7ml，置平臺(tái)待冷卻凝固后于37℃二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)約2d，平皿需倒置。

⑧取2倍濃縮的細(xì)胞培養(yǎng)液加入等量的2%瓊脂（預(yù)熱）中，每個(gè)平皿加入5ml，置平臺(tái)待冷卻凝固后于37℃二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)至次日。

（2）結(jié)果計(jì)算：求出每組3個(gè)培養(yǎng)皿的蝕斑平均數(shù)，組間蝕斑數(shù)的差異應(yīng)符合稀釋度的規(guī)律（即若10^－2組平均100個(gè)蝕斑，則10^-3組平均應(yīng)在10個(gè)左右），否則應(yīng)考慮重新試驗(yàn)。以平均蝕斑數(shù)乘以病毒稀釋的倍數(shù)再乘以5，即為每毫升病毒原液的蝕斑數(shù)。

選取特征性的若干蝕斑，分別以彎頭吸管在瓊脂層下吸取蝕斑以收獲病毒，然后分別接種到預(yù)先制備的單層細(xì)胞培養(yǎng)瓶中進(jìn)行增殖或傳代。

（三）病毒血清型鑒定試驗(yàn)（紙片法）

1.抗體紙片制備

（1）取已知各種血清型毒株以1×10⁷蝕斑形成單位接種綿羊，接種后3～4周采血分離血清。

（2）制備直徑0.5mm的中性濾紙片，121℃15min滅菌后保存于干燥環(huán)境。

（3）取上述濾紙片浸入不同血清型的免疫血清后真空凍干，保存于4℃冰箱備用，使用前以滅菌水濕潤(rùn)。

2.病毒接種

（1）用直徑6cm的塑料培養(yǎng)皿培養(yǎng)BHK₂₁或Vero細(xì)胞使成單層。

（2）以10³PFU/0.2ml被檢病毒接種于細(xì)胞上，吸附1h。

（3）洗去未被吸附的病毒，棄去洗液。

3.覆蓋瓊脂

（1）取2倍濃縮的細(xì)胞培養(yǎng)液加入等量的1.6%瓊脂，每個(gè)平皿加入7m1，置平臺(tái)冷卻凝固。

（2）在瓊脂面上按梅花形圖案放上不同型的血清濾紙片，并做好記號(hào)。

（3）把平皿放置在37℃二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)2d。

（4）真空吸出平皿中的濾紙片。

（5）取2倍濃縮的細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)液加入等量的2%瓊脂，每個(gè)平皿加入5ml，重新置37℃二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)2～3d，待明顯蝕斑抑制環(huán)出現(xiàn)。

4.結(jié)果判定：出現(xiàn)明顯抑制蝕斑形成（即濾紙片位置下仍保持活細(xì)胞被染色）的免疫血清即為該被檢病毒的血清型。

（四）病毒（NDV）分離

1.取疑似患病動(dòng)物的組織用細(xì)胞培養(yǎng)液勻漿，離心沉淀后取上清液。

2.用16孔微量培養(yǎng)板制備雞成纖維原代細(xì)胞。

3.細(xì)胞長(zhǎng)成單層后吸去培養(yǎng)液，向每孔滴加0.1ml被檢病料，置37℃吸附2h后棄殘液。

4.制備1%瓊脂的BME，置40℃～50℃水浴待用。

5.吸取上述瓊脂加入培養(yǎng)板各孔，每孔0.5ml，使冷卻凝固成覆蓋層。

6.把培養(yǎng)板倒置，在37℃二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h。

7.制備含0.002%中性紅的1%瓊脂的BME，置40℃～50℃水浴待用。

8.吸取上述瓊脂加入培養(yǎng)板各孔，每孔0.5ml，使冷卻凝固成第二覆蓋層。

9.把培養(yǎng)板倒置，在37℃二氧化碳培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，48h內(nèi)觀察結(jié)果。

10.挑出蝕斑下的細(xì)胞作病毒的進(jìn)一步增殖和鑒定。

注：本試驗(yàn)方法在樣品中病毒含量少的情況下比單純用細(xì)胞培養(yǎng)分離要敏感。

（五）試驗(yàn)用各種成分的配制

1.細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)液（用于稀釋病毒）

2.兩倍濃縮細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)液（配制首層瓊脂用）

3. 31.6%瓊脂

（121℃高壓滅菌15min，置40℃～45℃水浴備用）

4.含中性紅兩倍濃縮細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)液（配制第二層瓊脂用）

（置40℃～45℃水浴備用）

說(shuō)明：在第二層瓊脂中，中性紅的最終濃度應(yīng)為1∶5000～1∶10000

（112℃高壓滅菌15min，置40℃～45℃水浴備用）

二、變態(tài)反應(yīng)

變態(tài)反應(yīng)（Allergy）是指已免疫的動(dòng)物機(jī)體在接觸同一種抗原物質(zhì)時(shí)所發(fā)生的一種異常反應(yīng)，也叫超敏反應(yīng)（Hypersensitivity）。在抗原抗體反應(yīng)中，外來(lái)抗原所引起的免疫應(yīng)答對(duì)大多數(shù)反應(yīng)個(gè)體是有利的。但是有些應(yīng)答反應(yīng)能導(dǎo)致組織損傷，使機(jī)體生理功能紊亂，甚至休克死亡。變態(tài)反應(yīng)的實(shí)質(zhì)就是這種過(guò)強(qiáng)的病理性應(yīng)答反應(yīng)，其引發(fā)的疾病稱(chēng)變態(tài)反應(yīng)性疾病或免疫性疾病。常見(jiàn)變態(tài)反應(yīng)性疾病有全身性的，如過(guò)敏性休克、血清過(guò)敏等；有局部性的，如發(fā)生在呼吸道的支氣管哮喘、喉頭水腫、過(guò)敏性鼻炎；發(fā)生在皮膚的蕁麻疹、濕疹；發(fā)生在消化道的嘔吐、腹痛、腹瀉等。

變態(tài)反應(yīng)的發(fā)生有致敏階度和反應(yīng)階段。初次抗原刺激，經(jīng)一定的潛伏期，機(jī)體進(jìn)入致敏狀態(tài)，再受到同樣抗原的刺激時(shí)進(jìn)入反應(yīng)階段。變態(tài)反應(yīng)發(fā)生發(fā)展過(guò)程，一般具有以下幾個(gè)特點(diǎn)：①需有過(guò)敏原的刺激；②過(guò)敏原高度特異性，兩次過(guò)敏原必須相同；③需經(jīng)一定潛伏期，先使機(jī)體致敏；④變態(tài)反應(yīng)的表現(xiàn)與反應(yīng)的程度既決定于抗原的質(zhì)和量，也決定于機(jī)體的差別。

（一）變應(yīng)原

引起變態(tài)反應(yīng)的抗原稱(chēng)為變應(yīng)原（allergen）或過(guò)敏原（anaphylactogen）。變應(yīng)原種類(lèi)很多，可以是完全抗原，如微生物、寄生蟲(chóng)、昆蟲(chóng)毒液、異種動(dòng)物血清和組織提取物、疫苗、動(dòng)物皮毛和飼料等；也可以是半抗原，如青霉素、磺胺類(lèi)、阿司匹林等常用藥物和有機(jī)碘、汞劑等一些化學(xué)制劑，這些半抗原只有與蛋白質(zhì)結(jié)合后才表現(xiàn)變應(yīng)原性。

（二）變態(tài)反應(yīng)分類(lèi)

變態(tài)反應(yīng)發(fā)生的原因不一，臨診表現(xiàn)各異，Cool和Gell等人將其分為四個(gè)主要類(lèi)型，即Ⅰ型（過(guò)敏反應(yīng)）、Ⅱ型（細(xì)胞毒型）、Ⅲ型（免疫復(fù)合物型）和Ⅳ型（遲發(fā)型）。前三型均系抗體與抗原在體內(nèi)反應(yīng)所引起，屬體液性變態(tài)反應(yīng)。其共同點(diǎn)是反應(yīng)發(fā)生較快，有的在數(shù)分鐘內(nèi)達(dá)到反應(yīng)高峰，常稱(chēng)炎性速發(fā)型變態(tài)反應(yīng)。第Ⅳ型為細(xì)胞介導(dǎo)免疫應(yīng)答，反應(yīng)發(fā)生緩慢，一般在6～48h才達(dá)到反應(yīng)高峰，故稱(chēng)為遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)。也有提出V型和Ⅵ型。因V型為細(xì)胞刺激型，Ⅵ型是抗體殺傷細(xì)胞的一種類(lèi)型，兩者均被視為Ⅱ型反應(yīng)范疇，故大多數(shù)人仍采用四型分類(lèi)法。變態(tài)反應(yīng)雖有四種類(lèi)型，但任何一種抗原引發(fā)的變態(tài)反應(yīng)均由一種或數(shù)種機(jī)制引發(fā)。臨診上的變態(tài)反應(yīng)也常常幾種合并存在，以某一型為主。

（三）各型變態(tài)反應(yīng)

（1）I型變態(tài)反應(yīng)　出現(xiàn)迅速、反應(yīng)強(qiáng)烈。反應(yīng)可限于一種組織，也可波及全身。所表現(xiàn)的癥狀和嚴(yán)重程度差異較大、但很多時(shí)候是致命性的全身反應(yīng)。該型常稱(chēng)過(guò)敏反應(yīng)（anaphylactic reaction）。機(jī)體受到變應(yīng)原刺激后，產(chǎn)生相當(dāng)量的IgE抗體。IgE具有親細(xì)胞的特性，通過(guò)Fc段結(jié)合在組織中的肥大細(xì)胞和血流中的嗜堿性粒細(xì)胞表面，結(jié)合后的IgE比較穩(wěn)定，此時(shí)，機(jī)體處于致敏狀態(tài)。這種致敏狀態(tài)常于第一次接觸抗原后二周開(kāi)始形成，可維持半年至數(shù)年。以后若再無(wú)同種抗原刺激，致敏狀態(tài)便逐漸消失。

機(jī)體致敏后，當(dāng)同種變應(yīng)原再次進(jìn)入時(shí)，便與肥大細(xì)胞或嗜堿性粒細(xì)胞表面的IgE結(jié)合，單個(gè)變應(yīng)原分子可與至少兩個(gè)相鄰近的IgE分子結(jié)合，聯(lián)結(jié)成橋狀的變應(yīng)原－IgE復(fù)合物。形成的復(fù)合物能激活肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞，促使細(xì)胞內(nèi)多種嗜堿性顆粒被排出。這些脫出的顆粒和細(xì)胞釋放出各種生物活性介質(zhì)，如組織受體、5－羥色胺等，同時(shí)血漿中的激肽原被活化成激肽。這些活性介質(zhì)作用于相應(yīng)的組織器官，引起毛細(xì)血管擴(kuò)張，血管壁通透性增加，平滑肌收縮，腺體分泌增多等。I型變態(tài)反應(yīng)雖然發(fā)生快而強(qiáng)烈，甚至導(dǎo)致突然休克，但消退亦快，補(bǔ)體不參與反應(yīng)，所以?xún)H能引起生理機(jī)能紊亂，而無(wú)后遺性組織損傷；發(fā)病有明顯的個(gè)體差異，只有過(guò)敏性體質(zhì)的機(jī)體才易發(fā)生。

2.Ⅱ型變態(tài)反應(yīng)　是抗體（IgG或IgM）與相應(yīng)的細(xì)胞或組織上的抗原結(jié)合，在補(bǔ)體、巨噬細(xì)胞和K細(xì)胞的參與下，造成細(xì)胞溶解、損傷，或被單核細(xì)胞所吞噬的反應(yīng)，也稱(chēng)為細(xì)胞毒型（cytotocictype）變態(tài)反應(yīng)，臨診上許多免疫性血液病均屬此型。

3.Ⅲ型變態(tài)反應(yīng)　是由免疫復(fù)合物所引起，因此稱(chēng)為免疫復(fù)合物型（immune complextype）或脈管炎型（vaseultitis type）。該型變態(tài)反應(yīng)與免疫復(fù)合物的大小有密切關(guān)系。臨診表現(xiàn)與反應(yīng)的部位有關(guān)。當(dāng)抗原進(jìn)入已免疫的機(jī)體內(nèi)，與抗體（IgG、IgM）在循環(huán)或體液中結(jié)合，形成中等大小的抗原-抗體復(fù)合物，若能及時(shí)被清除，便沉積于局部毛細(xì)血管壁基底膜，激活補(bǔ)體、導(dǎo)致中性粒細(xì)胞聚集，引起血管炎病，危害機(jī)體。

本型變態(tài)反應(yīng)可以引起局部免疫復(fù)合物病，如阿薩斯（Arthus）反應(yīng)和全身的血清病樣反應(yīng)。阿薩斯反應(yīng)是在注射抗原的局部形成免疫復(fù)合物，致使局部發(fā)生水腫、出血、壞死的劇烈炎性反應(yīng)。血清病樣反應(yīng)是動(dòng)物初次接受血清注射后產(chǎn)生的抗體與尚未完全清除的抗原結(jié)合成中等大小的循環(huán)免疫復(fù)合物而引起。因免疫復(fù)合物可經(jīng)循環(huán)遍布全身，故常引起全身反應(yīng)，如發(fā)熱、皮疹、淋巴結(jié)腫大等。某些藥物如青霉素、磺胺等，如長(zhǎng)期使用，也能發(fā)生類(lèi)似的血液病樣反應(yīng)，稱(chēng)藥物熱。

4.Ⅳ型變態(tài)反應(yīng)　是機(jī)體再次接觸同種抗原許多小時(shí)后發(fā)生的一種以細(xì)胞免疫局部反應(yīng)為主的反應(yīng)。所以稱(chēng)為遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)（delayed allergy）或細(xì)胞介導(dǎo)型（cell－mediate type）。在該型反應(yīng)中抗體不起作用，也無(wú)補(bǔ)體參與，而由致敏淋巴細(xì)胞（T細(xì)胞）、單核巨噬細(xì)胞等聚集于反應(yīng)局部引起免疫損傷。該型反應(yīng)主要有傳染性變態(tài)反應(yīng)、接觸性皮炎、移植排斥反應(yīng)和自身免疫性變態(tài)反應(yīng)。引起Ⅳ型變態(tài)反應(yīng)的變應(yīng)原可為微生物、寄生蟲(chóng)和異體組織等，也可以是半抗原。當(dāng)這類(lèi)抗原進(jìn)入體內(nèi)后，刺激T淋巴細(xì)胞引起分化增殖，轉(zhuǎn)化為致敏淋巴細(xì)胞，使機(jī)體進(jìn)入致敏狀態(tài)，此階段需1～2周。當(dāng)機(jī)體再次接觸同種變應(yīng)原時(shí)，刺激致敏淋巴細(xì)胞釋放各種淋巴因子，主要有巨噬細(xì)胞趨化因子、巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子和巨噬細(xì)胞活化因子。這些因子加速骨髓單核-巨噬細(xì)胞增殖、釋放，并向抗原部位集中，發(fā)揮吞噬作用，引起以單核細(xì)胞浸潤(rùn)為主的局部炎癥反應(yīng)。同時(shí)巨噬細(xì)胞釋出的溶酶體酶能損傷鄰近組織細(xì)胞，使組織變性和壞死。再加上皮膚反應(yīng)因子和淋巴毒素的作用，使局部毛細(xì)血管通透性增加而充血、水腫。在反應(yīng)中，殺傷T細(xì)胞能識(shí)別靶細(xì)胞表面抗原，與之結(jié)合，直接殺傷靶細(xì)胞。該型變態(tài)反應(yīng)是以淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞為主的滲出性炎性反應(yīng)。由于細(xì)胞的激活、增殖、分化和聚集需要時(shí)間長(zhǎng)，反應(yīng)發(fā)生較緩慢，一般在再次接觸抗原6～48h，反應(yīng)才達(dá)高于某些胞內(nèi)寄生菌（如結(jié)核桿菌、副結(jié)核桿菌、布氏桿菌等）和病毒等外來(lái)抗原的細(xì)胞免疫力。由于反應(yīng)過(guò)于強(qiáng)烈，造成組織的嚴(yán)重?fù)p傷，于機(jī)體不利；如果是組織移植，這種反應(yīng)顯然有害。遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)具有明顯的利用之處。傳染性變態(tài)反應(yīng)，常常用來(lái)作為某些慢性傳染病的診斷依據(jù)。如結(jié)核、副結(jié)核、馬鼻疽、布氏桿菌病、野兔熱、馬流行性淋巴管炎等，就是明顯的例子。

（四）動(dòng)物疫病的變態(tài)反應(yīng)診斷

某些傳染原引起的傳染性變態(tài)反應(yīng)，具有很高的特異性，可用于傳染病診斷。在動(dòng)物疫病診斷檢疫中，常用的方法有皮內(nèi)反應(yīng)法、點(diǎn)眼法和皮下反應(yīng)法?？乖苿┯斜蔷揖亍⒔Y(jié)核菌素、布氏桿菌水解素、副結(jié)核菌素等。接種的部位因動(dòng)物種類(lèi)和傳染病而異，馬采用頸側(cè)和眼瞼；牛、羊除頸側(cè)外，還可在尾根及肩胛中央部位；豬大多在耳根后，雞在肉髯部位，猴在眼瞼或腹部皮膚。各種抗原制劑接種的劑量也有不同，可參見(jiàn)使用說(shuō)明。

1.牛結(jié)核菌素變態(tài)反應(yīng)檢驗(yàn)　牛結(jié)核菌素變態(tài)反應(yīng)檢驗(yàn)有三種方法，即皮內(nèi)反應(yīng)、點(diǎn)眼反應(yīng)及皮下反應(yīng)。我國(guó)主要采用前兩種方法，兩種方法最好同時(shí)并用。

（1）結(jié)核菌素皮內(nèi)反應(yīng)

①注射部位：在左頸側(cè)中部上1/3處（3個(gè)月以?xún)?nèi)犢牛可在肩胛部）。先剪毛，直徑約10cm，然后用卡尺測(cè)量術(shù)部中央皮皺厚度。如術(shù)部有創(chuàng)傷、化膿或硬結(jié)等變化時(shí)，應(yīng)另選部位或在對(duì)側(cè)進(jìn)行。

②注射劑量：用結(jié)核菌素原液，3個(gè)月以?xún)?nèi)的小牛0.1ml；3個(gè)月至1歲牛0.15ml：1歲以上的牛0.2ml。

③注射方法：先用酒精棉球消毒術(shù)部，然后向皮內(nèi)注入規(guī)定量的結(jié)核菌素原液，注射后注射部位應(yīng)出現(xiàn)豆大小泡，如注射不正確或有疑問(wèn)，應(yīng)另選術(shù)部重作。每注射一頭牛后，用酒精棉球擦拭針頭。

④觀察反應(yīng)：皮內(nèi)注射后，應(yīng)分別在72h、120h進(jìn)行2次觀察，注意局部有無(wú)熱、痛、腫脹等炎性反應(yīng)，并以卡尺測(cè)量術(shù)部腫脹面積及皮皺厚度。

在第72h觀察后，對(duì)呈陰性及可疑反應(yīng)的牛只，需在原注射部位，以同一劑量進(jìn)行第2次注射。第2次注射后應(yīng)于第48h時(shí)（即120h）再觀察一次。

（2）判定

陽(yáng)性反應(yīng)：局部發(fā)熱、有痛感并呈現(xiàn)界限不明顯的彌漫性水腫，質(zhì)地如面團(tuán)，腫脹面只在35mm×45mm以上，或上述反應(yīng)較輕，而皺皮厚度在原測(cè)量基礎(chǔ)上增加8mm以上者，為陽(yáng)性反應(yīng)，其記錄符號(hào)為（＋）。

疑似反應(yīng)：局部炎性水腫不明顯，腫脹面積在35mm×45mm以下者，皮厚增加在5～8mm間，為疑似反應(yīng)，其記錄符號(hào)為（±）。

陰性反應(yīng)：局部無(wú)炎性水腫，或僅有無(wú)熱堅(jiān)實(shí)及界限明顯的硬塊，皮厚增加不超過(guò)5mm者，為陰性反應(yīng)，其記錄符號(hào)為（一）。

2.結(jié)核菌素點(diǎn)眼反應(yīng)　牛結(jié)核菌素點(diǎn)眼，每次進(jìn)行兩回，間隔3～5d。

（1）方法：點(diǎn)眼前對(duì)兩眼作詳細(xì)檢查，正常時(shí)方可點(diǎn)眼；有眼病或結(jié)膜不正常者，不可作點(diǎn)眼檢疫。結(jié)核菌素一般點(diǎn)于左眼，左眼有眼病可點(diǎn)于右眼，但需在記錄上說(shuō)明。用量為3～5滴，0.2～0.3ml。點(diǎn)眼后，注意將牛拴好，防止風(fēng)沙侵入眼內(nèi)，避免陽(yáng)光直射及牛頭部與周?chē)矬w摩擦。

（2）觀察反應(yīng)：點(diǎn)眼后，應(yīng)于第3h、6h、9h各觀察一次，必要時(shí)可觀察第24h的反應(yīng)。應(yīng)觀察兩眼的結(jié)膜與眼瞼腫脹的狀態(tài)，流淚及分泌物的性質(zhì)與量的多少。由于結(jié)核菌素而引起的飲食減少或停止以及全身戰(zhàn)栗、呻吟、不安等其他變態(tài)反應(yīng)，均應(yīng)詳細(xì)記錄。陰性和可疑的牛72h后，于同一眼內(nèi)再點(diǎn)一次結(jié)核菌素，觀察記錄同上。

（3）判定

①陽(yáng)性反應(yīng)：有兩個(gè)大米粒大，或有2mm×10mm以上的呈黃白色的膿性分泌物自眼角流出，或散布在眼的周?chē)蚍e聚在結(jié)膜囊及其眼角內(nèi)，或上述反應(yīng)較輕，但有明顯的結(jié)膜充血、水腫、流淚并有其他全身反應(yīng)者，為陽(yáng)性反應(yīng)。

②疑似反應(yīng)：有兩個(gè)大米粒大，或有2mm×10mm以上的灰白色、半透明的黏液性分泌勿積聚在結(jié)膜囊內(nèi)或眼角處，并無(wú)明顯的眼瞼水腫及其他全身癥狀者，判為疑似反應(yīng)。

③陰性反應(yīng)：無(wú)反應(yīng)或僅有結(jié)膜輕微充血，流出透明漿液性分泌物者，為陰性反應(yīng)。

④綜合判定：結(jié)核菌素皮內(nèi)注射與點(diǎn)眼反應(yīng)兩種方法中的任何一種呈陽(yáng)性反應(yīng)者，即判定為結(jié)核菌素陽(yáng)性反應(yīng)牛；兩種方法中任何方法為疑似反應(yīng)者，判定為疑似反應(yīng)牛。

⑤復(fù)檢：在健康牛群中（即無(wú)1頭變態(tài)反應(yīng)陽(yáng)性的牛群）經(jīng)第二次檢疫判定為可疑的牛，要單獨(dú)隔離飼養(yǎng)，一個(gè)月后作第二次檢疫，仍為可疑時(shí)，經(jīng)半個(gè)月作第三次檢疫，如仍為可疑，可繼續(xù)觀察一定時(shí)間后再進(jìn)行檢疫，根據(jù)檢疫結(jié)果作出適當(dāng)處理。

3.牛副結(jié)核變態(tài)反應(yīng)檢驗(yàn)：為了查清隱性副結(jié)核病牛，可以用副結(jié)核菌素或禽型結(jié)核菌素作皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)檢查。其注射劑量為：1月齡至1歲的牛0.1ml；1歲以上至3歲0.2ml；3歲以上0.3ml。其注射部位、注射方法、反應(yīng)觀察、判定標(biāo)準(zhǔn)與牛結(jié)核皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)基本相似。對(duì)皮內(nèi)反應(yīng)疑似牛，應(yīng)做好明顯標(biāo)記，經(jīng)15～30d再作第2次皮內(nèi)反應(yīng)，如仍為疑似反應(yīng)，再以同樣間隔作第3次檢查。重檢時(shí)應(yīng)另選注射部位。對(duì)連續(xù)3次疑似反應(yīng)牛，應(yīng)酌情處理。

4.布氏桿菌變態(tài)反應(yīng)檢驗(yàn)　布氏桿菌變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)，是用不同類(lèi)型的抗原進(jìn)行布氏桿菌病診斷的方法之一。布氏桿菌水解素（即變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)的一種抗原），是專(zhuān)用于綿羊及山羊的布氏桿菌病變態(tài)反應(yīng)檢查。

如果在牛群中發(fā)現(xiàn)有開(kāi)放性結(jié)核牛，同群牛如有可疑反應(yīng)的牛只，也應(yīng)視為被感染。通過(guò)兩次檢疫都為可疑者，即可判為結(jié)核菌素陽(yáng)性牛。

（1）操作步驟：使用細(xì)針頭，將布氏桿菌水解素注射于羊尾根皺褶或肘關(guān)節(jié)無(wú)毛處皮內(nèi)，劑量為0.2ml。注射前應(yīng)將注射部位用酒精棉消毒，每注射1只羊，均需用酒精棉消毒針頭。如注射正確，會(huì)在注射部位形成綠豆大的硬包。布氏桿菌病羊在注射部位發(fā)生炎性反應(yīng)（水腫，略潮紅），而健羊則無(wú)此反應(yīng)。

（2）結(jié)果判定：注射后24h和48h各觀察1次（用肉眼觀察和觸診方法檢查注射局部反應(yīng)）。若兩次觀察反應(yīng)結(jié)果不符時(shí)，以反應(yīng)最強(qiáng)的一次作為判定依據(jù)。判定標(biāo)準(zhǔn)是：

強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)（＋＋＋）：注射部位有明顯不同程度的腫脹和發(fā)紅（硬腫或水腫），無(wú)需觸診憑肉眼即可察出者。

陽(yáng)性反應(yīng)（＋＋）：腫脹程度不如上述現(xiàn)象明顯，但也容易看出。

弱陽(yáng)性反應(yīng)（＋）：腫脹程度也不顯著，有時(shí)需靠觸診才能發(fā)現(xiàn)。

疑似反應(yīng)（±）：腫脹程度似不明顯，通常需與對(duì)側(cè)比較才能察覺(jué)者。

陰性反應(yīng)（-）：注射部位無(wú)任何變化。

可疑反應(yīng)羊經(jīng)30d后復(fù)檢。復(fù)檢如無(wú)反應(yīng)，即以健康羊?qū)Υ?；如仍為可疑，則按陽(yáng)性羊處理。

（3）注意事項(xiàng)：?jiǎn)⒎夂蟮氖Ｓ嗨馑夭坏美^續(xù)使用。注射水解素后，健康羊不產(chǎn)生凝集素，病羊的凝集素不增高，所以不影響血清學(xué)檢驗(yàn)。

5.鼻疽變態(tài)反應(yīng)檢驗(yàn)

（1）鼻疽菌素點(diǎn)眼試驗(yàn)

①點(diǎn)眼前準(zhǔn)備：在進(jìn)行點(diǎn)眼前的第1d選好馬騾集中場(chǎng)所，作好一切準(zhǔn)備工作。

②組織人員分工：術(shù)者1人，助手1人，記錄1人，保定1～2人。

③器材準(zhǔn)備：消毒點(diǎn)眼管2～3支，消毒盤(pán)1個(gè)，適量鼻疽菌素（馬來(lái)因），硼酸棉球，紗布，記錄本，來(lái)蘇兒，工作服，口罩，眼鏡，毛巾及保定用具。

（2）點(diǎn)眼注意事項(xiàng)

①拴馬時(shí)必須背向太陽(yáng)，在廄內(nèi)時(shí)，馬頭需向通路。

②點(diǎn)眼前應(yīng)詳細(xì)檢查眼內(nèi)有無(wú)異物，結(jié)膜、角膜有無(wú)損傷。正常者方可進(jìn)行點(diǎn)眼。點(diǎn)眼畢，檢查頜下淋巴結(jié)、皮膚及鼻腔。均應(yīng)詳細(xì)記錄。

③一般均點(diǎn)于左眼，如左眼有異常則點(diǎn)右眼，但必須在籠頭上系1布條作為標(biāo)志。

④點(diǎn)眼時(shí)間一般規(guī)定從早晨開(kāi)始，爭(zhēng)取在9點(diǎn)鐘前結(jié)束。

⑤點(diǎn)眼試驗(yàn)第1次呈陰性及疑似反應(yīng)者，應(yīng)作第2回點(diǎn)眼，其間隔為5～6d。每次點(diǎn)眼用鼻疽菌素原液3～4滴，第2次點(diǎn)眼時(shí)應(yīng)點(diǎn)入同一眼中。

⑥點(diǎn)眼后，馬匹應(yīng)拴系確實(shí)；防止風(fēng)沙侵入及陽(yáng)光直射；指定專(zhuān)人看管，防止馬匹相互啃咬或摩擦眼睛。

（3）操作方法：點(diǎn)眼時(shí)，由助手固定馬頭，術(shù)者左手食指插入上眼瞼窩內(nèi)，使瞬膜露出，用拇指撥開(kāi)下眼瞼，使瞬膜和下眼瞼構(gòu)成凹陷，右手持吸有鼻疽菌素的點(diǎn)眼管保持水平方向，手掌下緣放在頜骨的眶部，點(diǎn)眼管尖部距凹陷約1cm，拇指按膠皮乳頭，滴入鼻疽菌素3～4滴（0.2～0.3ml）。此時(shí)，馬如頻頻瞬睫，低頭砸唇，即為點(diǎn)眼確實(shí)，若伸頸使瞬膜露出或閉眼流淚甚多時(shí)，有時(shí)可能將鼻疽菌素排出，應(yīng)立即重點(diǎn)1次。

（4）檢查時(shí)間：應(yīng)在點(diǎn)眼后第3h、6h、9h共檢查3次，并盡可能做到在第24h再檢查一次。在第6h檢查時(shí)，要翻開(kāi)眼瞼，其余時(shí)間觀察，必要時(shí)亦應(yīng)翻開(kāi)眼瞼檢查。

（5）判定標(biāo)準(zhǔn)

陽(yáng)性反應(yīng)（＋）：結(jié)膜發(fā)炎，腫脹明顯，分泌物為膿性者。

疑似反應(yīng)（±）：結(jié)膜潮紅，輕度腫脹，分泌物為灰白色漿性及黏性（非膿性）者。

陰性反應(yīng)（-）：點(diǎn)眼后無(wú)反應(yīng)者，或結(jié)膜輕微充血及流淚者。

6.鼻疽菌素皮下注射試驗(yàn)（熱反應(yīng)）

（1）注射前注意事項(xiàng)：皮下注射前1d，被檢動(dòng)物必須作一般臨床檢查，于早、午、晚測(cè)3次體溫并詳細(xì)記載。體溫正常者方可作皮下注射。在3次體溫記錄中，其中如有一次超過(guò)39℃和3次平均體溫超過(guò)38.5℃，以及在前1次皮下注射后，尚未經(jīng)過(guò)1個(gè)半月以上者，均不得作皮下注射。

（2）注射部位及劑量：注射部位通常在頸左側(cè)或肩前胸部。注射前，術(shù)部先行剪毛消毒，注射量為鼻疽菌素原液1ml。

（3）注射時(shí)間：通常在夜間12點(diǎn)鐘注射，自次日晨（即注射后第6h）開(kāi)始測(cè)溫，每2h測(cè)溫1次，連測(cè)10次，再于第36h測(cè)溫1次，將測(cè)溫結(jié)果記錄下來(lái)畫(huà)成曲線，并記錄局部腫脹程度，以備判定。

（4）注射后注意事項(xiàng)：注射后的牲畜在24h內(nèi)不得使役，并不能飲冷水。

（5）注射后的反應(yīng)：皮下注射鼻疽菌素后，馬、騾、驢及駱駝均可發(fā)生體溫反應(yīng)及局部或全身反應(yīng)。

①體溫反應(yīng)。鼻疽病畜經(jīng)皮下注射后，至第6～8h體溫開(kāi)始上升，第12～16h體溫升到最高峰，以后即逐漸降低，亦有于第30～36h內(nèi)體溫再度輕微上升。

②局部反應(yīng)。注射部位發(fā)熱、腫脹、疼痛，以24～36h最為顯著，直徑可達(dá)10～20cm，繼而逐漸消散，有時(shí)腫脹持續(xù)2～3d。

③全身反應(yīng)。注射后精神不振，食欲減退，呼吸急促，脈搏加快，步態(tài)踉蹌，戰(zhàn)栗，大小便次數(shù)增加，頜下淋巴結(jié)腫大等。

（6）判定標(biāo)準(zhǔn)

陽(yáng)性反應(yīng)：體溫升到40℃以上，呈稽留熱，并有輕微的局部反應(yīng)，或體溫稽留在39.6℃以上，并有顯著的局部反應(yīng)及全身反應(yīng)。

疑似反應(yīng)：體溫雖有升高，但不超過(guò)39.6℃，且有輕度的全身反應(yīng)及局部反應(yīng)等，或體溫一度升到40℃而不稽留并無(wú)局部反應(yīng)。

陰性反應(yīng)：體溫在39℃以下，并無(wú)局部及全身反應(yīng)者。

皮下反應(yīng)法比皮內(nèi)法操作繁瑣，而且檢出率低，反應(yīng)不如皮內(nèi)法敏感易判，因此較少采用。

三、免疫電鏡技術(shù)

近年來(lái)，免疫學(xué)方法與電鏡技術(shù)相結(jié)合，形成了一種免疫電鏡技術(shù)（Immun oelectron- microscopy，IEM），使抗原定位達(dá)到了亞細(xì)胞水平。免疫電鏡技術(shù)為抗原亞細(xì)胞水平定位提供了有力工具，也為病毒病快速診斷提供了一個(gè)新方法。近幾年來(lái)，有些科技工作者利用不同標(biāo)記物在電鏡下呈現(xiàn)不同的形態(tài)和電子密度的特點(diǎn)，建立了一些雙標(biāo)記或多標(biāo)記免疫電鏡技術(shù)，可在同一反應(yīng)系統(tǒng)中，同時(shí)觀察不同抗原及受體在細(xì)胞表面和細(xì)胞結(jié)構(gòu)中的定位。該項(xiàng)技術(shù)由以下環(huán)節(jié)組成。

（一）組織準(zhǔn)備

用于免疫電鏡檢測(cè)的組織多種多樣，所以各自在組織制備時(shí)都有其特點(diǎn)。一般講，組織力求新鮮并進(jìn)行無(wú)活力狀態(tài)處理，例如樹(shù)膠包埋等，避開(kāi)高溫（55℃～66℃），所用溶液應(yīng)是中性緩沖液。

1.固定　常用的固定液有甲醛和戊二醛。使用時(shí)要注意固定試劑pH值，滲透壓應(yīng)調(diào)整到“生理”狀態(tài)。另外四氧化鋨也是一種良好的膜穩(wěn)定劑。

2.固定后處理　組織長(zhǎng)時(shí)間浸于脫水溶劑、液相樹(shù)脂中時(shí)會(huì)抽走分子較小的可溶性抗原，另外超薄樹(shù)脂包埋切片長(zhǎng)時(shí)間與免疫試劑作用（如24～48h）會(huì)引起形態(tài)學(xué)的改變，而采用冰凍切片在很大程度上彌補(bǔ)了這一缺點(diǎn)。近年來(lái)，有人在后處理時(shí)對(duì)組織進(jìn)行急凍，然后真空抽干，再用鋨蒸氣固定后，用阿拉伯樹(shù)脂包埋。

（二）切片制備

冰凍超薄切片是免疫電鏡技術(shù)中應(yīng)用最廣泛的。先將細(xì)胞或組織輕微固定后，用2.3mol/L蔗糖浸潤(rùn)速凍，然后進(jìn)行切片。辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記，或膠體金、鐵蛋白、葡萄糖鐵標(biāo)記的抗體均可用于該方法的免疫染色。

1.包埋前處理技術(shù)　這一方法作為首選用于細(xì)胞表面抗原及受體的定位，亦可用于檢測(cè)那些易被脫水劑及樹(shù)脂成分變性的抗原。首先用切片刀將新鮮或固定的組織切成20至幾百微米厚，然后用改良的間接免疫酶技術(shù)進(jìn)行染色，在試劑中加入TyitonX－100增加其穿透性，用四氧化鋨固定，增加DAB染色反差。最后再包埋制成切片。一般認(rèn)為，在組織中切面下方2～4μm是染色較理想的部位。

2.包埋后切片技術(shù)　包括兩種方法，一是用包埋好的組織切成一般切片，免疫染色后用于光鏡檢查，同時(shí)作系列超薄切片染色并用電鏡觀察，將光鏡得到的結(jié)果與電鏡觀察結(jié)果比較，推斷抗原所在部位。這一方法的缺點(diǎn)是不能在亞細(xì)胞水平直接定位。另一種方法將包埋后組織直接進(jìn)行超薄切片染色，酶標(biāo)記與膠體金標(biāo)記的抗體可用這一方法。

（三）標(biāo)記物選擇

1.辣根過(guò)氧化物酶　是最常用的一種標(biāo)記物，性質(zhì)穩(wěn)定，分子量小，易穿透組織，在標(biāo)記過(guò)程幾乎不受損。其底物為3，3’－二氨基聯(lián)苯胺，可通過(guò)鋨化或氯化鈷作用增加其電子密度。

2.鐵蛋白及葡聚糖鐵顆粒　首先用免疫電鏡標(biāo)記的是馬脾臟鐵蛋白。應(yīng)用雙功試劑（如間位苯二甲基二異氰酸m－Xylylene diisocynste）可將鐵蛋白偶聯(lián)于抗體球蛋白分子上，因鐵蛋白分子量大不易穿透，故常采用冰凍超薄切片技術(shù)和包埋前處理切片技術(shù)。葡聚糖鐵顆粒用于免疫標(biāo)記時(shí)可采用上述方法。

3.放射性標(biāo)記　該方法已有人應(yīng)用，采用內(nèi)標(biāo)記法將同位素標(biāo)記到抗體球蛋白分子上。

4.重金屬　應(yīng)用不廣泛。用膠體金、水銀、鐵、鈾標(biāo)記抗體等。鈾離子能非特異性的結(jié)合在整個(gè)抗體分子上。因此需先將抗原與抗體結(jié)合，再將抗原與抗體分開(kāi)，除去抗原成分，即得到未失去免疫活性的鈾標(biāo)記抗體。膠體金能吸附于免疫球蛋白上，吸附的抗體以30000r/min離心沉淀，膠體金標(biāo)記抗體可保存6個(gè)月（5℃），不耐凍結(jié)。

5.血藍(lán)蛋白　無(wú)脊椎動(dòng)物的血藍(lán)蛋白形態(tài)規(guī)則，在電鏡下容易辨認(rèn)，可從鱟、角螺、文蛤等的血淋巴液中提取，其分子量達(dá)900萬(wàn)，可用ConA、戊二醛將抗體球蛋白分子聯(lián)結(jié)于血藍(lán)蛋白上。

（四）免疫電鏡技術(shù)操作方法

標(biāo)記抗體染色程序可根據(jù)不同需要，進(jìn)行直接法、間接法、雜交抗體等方法，就像酶標(biāo)記抗體一樣。下面介紹幾種常見(jiàn)的免疫電鏡操作程序。

1.病毒的電鏡凝結(jié)試驗(yàn)　近年來(lái)由于電鏡技術(shù)的發(fā)展，病毒的電鏡凝結(jié)已被用做常規(guī)的檢驗(yàn)手段。用于電鏡檢查的病毒懸液需先經(jīng)適當(dāng)?shù)奶峒兒蜐饪s。細(xì)胞培養(yǎng)中的病毒經(jīng)凍融裂解后，差速離心使病毒沉淀，將沉淀的病毒懸于適量生理鹽水中，取一滴病毒懸液和一滴抗血清，混合后4℃過(guò)夜，然后再加一滴3%磷鎢酸負(fù)染，滴于被有炭膜的銅網(wǎng)上，吸干，即可作電鏡檢查。可見(jiàn)病毒顆粒凝結(jié)成團(tuán)，并見(jiàn)有抗體分子的暈，病毒顆粒之間保持著一定距離。在最佳透射條件下，可看到單獨(dú)的、近球形的抗體分子，有時(shí)在病毒顆粒之間連成橋。檢查時(shí)，要注意與自然形成的病毒團(tuán)相區(qū)別，必須設(shè)未加血清的對(duì)照。電鏡凝結(jié)試驗(yàn)可進(jìn)行病毒的確切鑒定。

2.冰凍超薄切片的免疫染色　將組織用甲醛或戊二醛固定，切成0.5mm³大小，置0.6～2.3mol/L蔗糖溶液滲透，然后速凍（液氮等），超薄切片，展于用炭膜包被后的銅網(wǎng)上，切片面向下置于含0.3%瓊脂和1%明膠的濕盤(pán)上，通過(guò)滲透作用除去蔗糖，再用含0.01～0.2mol/L甘氨酸的PBS（PBS－g）漂浮銅網(wǎng)，然后在銅網(wǎng)上滴加含2%明膠PBS，放置10min，再按下列步驟進(jìn)行。

（1）PBS－g液中置10min后，PBS漂洗。

（2）采用工作濃度的抗血清孵育，稀釋液中常加明膠或白蛋白（0.4W.V），孵育的溫度與時(shí)間都需要試驗(yàn)比較得出。

（3）PBS漂洗。

（4）膠體金標(biāo)記二抗（工作濃度、作用時(shí)間和溫度均需進(jìn)行測(cè)定）作用后，PBS漂洗。

（5）置于含2%戊二醛水溶液中5min，水漂洗，晾干后電鏡觀察。注意同時(shí)設(shè)置陰性、陽(yáng)性對(duì)照。

3.辣根過(guò)氧化物酶－抗辣根過(guò)氧化物酶（peroxidaseantiperoxidase，PAP）組化法這一方法主要用于包埋前切片技術(shù)。首先將組織用含4%甲醛和0.2%戊二醛的0.1mol／L磷酸鹽緩沖液（pH7.4）浸泡固定2～4h（4℃），再用2.3mol/L蔗糖溶液滲透6～8h，液氮速凍后放在2.3mol/L蔗糖溶液中解凍，然后轉(zhuǎn)移到PBS中。這一速凍和解凍過(guò)程主要是為了不影響超微結(jié)構(gòu)的前提下凍破細(xì)胞以利于標(biāo)記物及免疫試劑的順利穿透。步驟如下。

（1）用Vibratome將組織切成20～50μm厚的薄片。

（2）10%正常血清（如羊或豬血清）作用30～60min，PBS漂洗。

（3）加一抗（羊抗兔血清1∶10～1∶100）作用1h，PBS洗。

（4）加二抗（羊兔血清）作用過(guò)夜。

（5）與辣根過(guò)氧化物酶－兔抗辣根過(guò)氧化物酶復(fù)合物（PAP）（1∶50）作用1.5～2h，PBS洗。

（6）置于含0.06% DNA、0.01% H₂O₂的0.05mol/L Tris－HCIpH7.6溶液中10min，然后浸入PBS溶液中終止反應(yīng)。

（7）用1%四氧化鋨作用2h，PBS漂洗。

（8）脫水進(jìn)行樹(shù)脂包埋，制電鏡超薄切片后觀察。