血糖濃度測(cè)定_生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)

實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目四　血糖濃度測(cè)定

學(xué)習(xí)目標(biāo)

【知識(shí)目標(biāo)】

（1）能用自己的語(yǔ)言描述用鄰甲苯胺法及葡萄糖氧化酶法檢測(cè)血糖濃度的原理。

（2）能夠迅速而準(zhǔn)確地陳述檢測(cè)血糖濃度的操作要點(diǎn)。

（3）能夠準(zhǔn)確描述比色法的原理。

【能力目標(biāo)】

（1）能在規(guī)定時(shí)間內(nèi)完成血糖濃度測(cè)定的各項(xiàng)操作內(nèi)容，做到步驟正確、動(dòng)作連貫協(xié)調(diào)、內(nèi)容全面無(wú)遺漏。

（2）能熟練使用分光光度計(jì)、半自動(dòng)生化分析儀。

（3）能準(zhǔn)確判斷檢測(cè)的血糖濃度是否在正常范圍內(nèi)，鑒別低血糖及高血糖。

案例引導(dǎo)

患者，男，66歲，近來(lái)嗜睡、疲乏無(wú)力，視力模糊，排尿量增多，并伴有頭痛、口苦、呼氣有異味，近來(lái)消瘦比較明顯。實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果顯示：血糖7.6mmol/L，酮體5.2mmol/L，尿糖（＋＋＋），尿蛋白（＋）。試解釋檢查結(jié)果，并初步診斷其可能患有何種疾病？

（提示：糖尿病）

血液中所含的葡萄糖，稱(chēng)為血糖。它是糖在體內(nèi)的運(yùn)輸形式。糖類(lèi)是機(jī)體重要的供能物質(zhì)，也是人體結(jié)構(gòu)的重要組成物質(zhì)之一。血糖濃度檢測(cè)可以反應(yīng)人體體內(nèi)糖代謝水平。目前，國(guó)內(nèi)醫(yī)院多采用鄰甲苯胺法和葡萄糖氧化酶法測(cè)定血糖濃度。

一、鄰甲苯胺法

【實(shí)驗(yàn)原理】

（1）本實(shí)驗(yàn)采用鄰甲苯胺法測(cè)定血糖濃度。在鄰甲苯胺法測(cè)定過(guò)程中，由于血中絕大部分非糖物質(zhì)及抗凝劑中的氧化物同時(shí)被沉淀下來(lái)，因而不易出現(xiàn)假性、過(guò)高或過(guò)低情況，結(jié)果較可靠。其原理是葡萄糖在酸性介質(zhì)中加熱脫水，反應(yīng)生成5－羥甲基－2－呋喃甲醛（又稱(chēng)為羥甲基糠醛），分子中的醛基與鄰甲苯胺縮合成藍(lán)色（青色）的醛亞胺，在一定濃度范圍內(nèi)，此顏色的深淺與葡萄糖的含量呈正比，通過(guò)比色分析法可以定量。

（2）比色分析法是以生成有色產(chǎn)物的顯色反應(yīng)為基礎(chǔ)，通過(guò)比較或測(cè)定有色產(chǎn)物溶液顏色深淺度來(lái)確定待測(cè)物含量的方法。有些被檢測(cè)的物質(zhì)溶液本身就具有顏色，而有些物質(zhì)雖不具有顏色，但可在試樣中加入某種適宜的試劑，使其產(chǎn)生有色化合物，溶液顏色的深淺與試樣中該化學(xué)成分的含量呈正比。借助于光電比色計(jì)和分光光度計(jì)，在相同條件下對(duì)兩個(gè)性質(zhì)相同而濃度不同的溶液進(jìn)行測(cè)定，將未知含量的有色溶液和已知含量的有色溶液進(jìn)行比色，通過(guò)計(jì)算就可求出未知溶液的含量。本實(shí)驗(yàn)中，樣本血清中的葡萄糖按上述原理發(fā)生顏色反應(yīng)后，與同樣處理的已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖進(jìn)行比色測(cè)定，可測(cè)得樣本的血糖濃度。

【實(shí)驗(yàn)器材】

試管，試管架，吸量管，試管夾，721型分光光度計(jì)，電熱恒溫水浴箱，記號(hào)筆，普通臺(tái)式離心機(jī)，大燒杯，比色杯。

【藥品及試劑】

血清，蒸餾水，鄰甲苯胺試劑，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)存液，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液。

【試劑配制】

1.鄰甲苯胺試劑

稱(chēng)取硫脲2.5g，溶解于750mL冰醋酸中，再將此溶液移入1000mL容量瓶?jī)?nèi)，加鄰甲苯胺150mL及2.4%硼酸100mL，然后加冰醋酸至所需刻度。將配制好的溶液置于棕色瓶中，至少可用2個(gè)月。

2.55.56mmol/L葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)存液

準(zhǔn)確稱(chēng)取干燥純葡萄糖1000mg，用2.5g/L苯甲醛50mL溶解，移入100mL容量瓶中，加2.5g/L苯甲醛溶液至所需刻度。此液可在冰箱內(nèi)久存。

3.5.56mmol/L葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液

吸取標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖儲(chǔ)存液10mL于100mL容量瓶中，用2.5g/L苯甲醛溶液稀釋至刻度。

操作流程

【操作步驟】

1.樣品制備

直接采用非抗凝血分離血清或采集抗凝血樣品，以3000r/min的離心速度離心，10min即可分離。

2.顯色反應(yīng)

取10mL試管3支，標(biāo)號(hào)，按表3－3加入溶液。

表3－3　鄰甲苯胺法檢測(cè)血糖濃度顯色反應(yīng)操作步驟（單位：mL）

混合均勻，將各試管置于電熱恒溫水浴箱中煮沸20min，取出后冷卻。

3.比色測(cè)定

用721型分光光度計(jì)在630nm波長(zhǎng)以下時(shí)，可使用光徑為1.0cm的比色杯。以空白管調(diào)零，分別讀取樣品管和標(biāo)準(zhǔn)管的吸光度值A(chǔ)。

【實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理及結(jié)果分析】

用下列公式計(jì)算血糖濃度：

【注意事項(xiàng)】

（1）鄰甲苯胺具有毒性和腐蝕性，操作時(shí)要注意。

（2）本法不需要除去蛋白質(zhì)，鄰甲苯胺試劑只與糖醛起反應(yīng)，不與血中其他還原物質(zhì)起反應(yīng)。

（3）顯色反應(yīng)與水的含量有關(guān)，故應(yīng)使標(biāo)準(zhǔn)管和樣品管的含水量一致。

（4）溫度對(duì)顯色反應(yīng)有明顯影響，煮沸時(shí)間和溫度應(yīng)準(zhǔn)確控制。

（5）顯色后顏色不穩(wěn)定，室溫每放置1min，顏色降低0.15%。

（6）鄰甲苯胺試劑中冰醋酸濃度很高，若使用不當(dāng)容易損壞比色儀器。

（7）離心機(jī)的使用：

①離心前一定要配平（包括位置配平和重量配平）。

②使用時(shí)離心機(jī)的蓋子一定要蓋緊，以免發(fā)生意外。

③要等離心機(jī)完全靜止后才能打開(kāi)蓋子。

【實(shí)驗(yàn)意義】

正常值：健康成年人空腹血清葡萄糖濃度為3.9～6.4mmol/L。

二、葡萄糖氧化酶法

【實(shí)驗(yàn)原理】

葡萄糖氧化酶法（GOD－PAP）相較于鄰甲苯胺法，具有特異性強(qiáng)、價(jià)格低廉、方法簡(jiǎn)單等特點(diǎn)。GOD－PAP建立在1969年出現(xiàn)的Trinder法基礎(chǔ)之上。

在pH值為7.0的條件下，葡萄糖可由葡萄糖氧化酶（GOD）氧化成葡萄糖酸（D－葡萄糖酸－δ內(nèi)酯）及過(guò)氧化氫，后者在過(guò)氧化物酶（POD）的作用下，與苯酚及色原性受體4－氨基安替吡啉（4－AAP）作用，過(guò)氧化物酶催化過(guò)氧化氫，氧化色原物質(zhì)，生成紅色醌亞胺化合物，在505nm處有最大吸收峰。醌亞胺的生成量（顏色深淺）與葡萄糖量（濃度）呈正比，可求得血樣中葡萄糖含量。用本法測(cè)定的葡萄糖具有高度特異性，更能反映血中葡萄糖的真實(shí)含量，是科研工作中常用的葡萄糖測(cè)定方法。隨著試劑藥盒的推廣普及，此法也已廣泛應(yīng)用于臨床檢測(cè)。其反應(yīng)過(guò)程如下：

【實(shí)驗(yàn)器材】

試管，試管架，微量加樣器，半自動(dòng)生化分析儀（或分光光度計(jì)），記號(hào)筆，37℃恒溫水浴箱。

【藥品及試劑】

（1）新鮮無(wú)溶血血清。

（2）有商品試劑盒供應(yīng)，試劑盒的主要成分與實(shí)驗(yàn)濃度如表3－4所示。

表3－4　葡萄糖氧化酶法某試劑盒的主要成分與實(shí)驗(yàn)濃度

【試劑配制】

推薦使用有批準(zhǔn)文號(hào)的優(yōu)質(zhì)市售試劑盒。以下試劑配制僅供參考。

1.0.1mol/L磷酸鹽緩沖液（pH＝7.0）

溶解無(wú)水磷酸氫二鈉8.67g及無(wú)水磷酸二氫鉀5.3g于800mL蒸餾水中，用1 mol/L氫氧化鈉或鹽酸調(diào)節(jié)至pH值為7.0，然后用蒸餾水稀釋至1L。

2.酶試劑

取葡萄糖氧化酶1200U，過(guò)氧化物酶1200U，4－氨基安替吡啉10mg，加上述磷酸鹽緩沖液至80mL左右，調(diào)節(jié)至pH值為7.0，再加磷酸鹽緩沖液至100mL，置于冰箱中保存。至少可穩(wěn)定3個(gè)月。

3.酚溶液

將重蒸餾酚100mg溶于100mL蒸餾水中，儲(chǔ)存于棕色瓶?jī)?nèi)。

4.酶酚混合試劑

酶試劑及酚溶液等量混合，儲(chǔ)存于棕色瓶?jī)?nèi)。在冰箱中可以存放1個(gè)月。

5.12mmol/L苯甲酸溶液

于900mL蒸餾水中加入苯甲酸（M_W＝122.12）1.46g，加熱助溶，冷卻后置于1 L容量瓶中，加蒸餾水至所需刻度。

6.葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)存液（100mmol/L）

稱(chēng)取標(biāo)準(zhǔn)純度的無(wú)水葡萄糖（M_W＝180.16，預(yù)先置于80℃烤箱內(nèi)干燥恒重后，再移置于干燥器內(nèi)保存）1.802g，用12mmol/L苯甲酸溶液溶解后轉(zhuǎn)移到100mL容量瓶?jī)?nèi)，再以12mmol/L苯甲酸溶液稀釋至100mL刻度處，至少放置2h后方可使用。

7.葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液（5mmol/L）

吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)存液5mL，置于100mL容量瓶中，用12mmol/L苯甲酸溶液稀釋至所需刻度，混勻。

操作流程

【操作步驟】

1.工作液配制

將10mL R₁與90mL R₂混合均勻，即為工作液。

2.半自動(dòng)生化分析儀設(shè)置

參數(shù)設(shè)置→反應(yīng)液準(zhǔn)備→校準(zhǔn)→質(zhì)控。

3.顯色反應(yīng)

取試管3支，分別標(biāo)以1、2、3號(hào)，按表3－5進(jìn)行操作。

表3－5　葡萄糖氧化酶法檢測(cè)血糖濃度反應(yīng)操作步驟（單位：mL）

分別混勻，置于37℃恒溫水浴箱中，保溫10min（應(yīng)避免陽(yáng)光直射）。

4.比色測(cè)定

半自動(dòng)生化分析儀（或分光光度計(jì)）設(shè)置波長(zhǎng)為505nm，以空白管調(diào)零，分別讀取吸光度值A(chǔ)_{標(biāo)準(zhǔn)}和A_樣品或濃度。

【實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理及結(jié)果分析】

如讀取吸光度值A(chǔ)，則按下式計(jì)算結(jié)果：

【注意事項(xiàng)】

（1）酶酚混合液和樣品的用量可根據(jù)需要按比例改變，計(jì)算公式不變。

（2）因緩沖液中含有有毒的穩(wěn)定劑疊氮鈉，應(yīng)避免與皮膚接觸。

（3）酚試劑有毒，切勿吞咽。如果試劑溢出，請(qǐng)用大量水沖洗被污染的部位。

（4）使用完1mL血清吸管后應(yīng)立即洗凈，以免血清凝固在細(xì)管內(nèi)。

（5）本產(chǎn)品應(yīng)在2～8℃條件下儲(chǔ)存。

【實(shí)驗(yàn)意義】

1.正常值

健康成年人空腹血清葡萄糖濃度為3.89～6.11mmol/L（或參考試劑盒提供的參考范圍）。

2.意義

機(jī)體從碳水化合物的代謝中獲得血糖。葡萄糖是人體血液中最重要的單糖，血糖是維持細(xì)胞功能的能量供體。血糖濃度受神經(jīng)系統(tǒng)和激素的調(diào)節(jié)而保持相對(duì)穩(wěn)定，當(dāng)這些調(diào)節(jié)失去原有的相對(duì)平衡時(shí)則出現(xiàn)糖代謝紊亂。檢測(cè)葡萄糖的濃度對(duì)于糖代謝紊亂相關(guān)疾病的診斷、治療等具有重要的意義。

（1）高血糖：空腹血糖濃度高于7.0mmol/L。

①生理性或暫時(shí)性血糖濃度升高：注射葡萄糖或攝入高糖食物后、情緒緊張腎上腺素分泌增加時(shí)可導(dǎo)致生理性血糖濃度升高，但不應(yīng)超過(guò)10mmol/L。嘔吐、腹瀉、高熱等引起脫水可致血糖濃度輕度升高，為暫時(shí)性血糖濃度升高。

②病理性高血糖：內(nèi)分泌腺功能障礙能引起高血糖，如果胰腺β細(xì)胞損害或胰島素分泌不足導(dǎo)致胰島素缺乏，血糖濃度可超過(guò)正常范圍，臨床上稱(chēng)為糖尿病。內(nèi)分泌疾病引起的各種對(duì)抗胰島素的激素分泌增加也會(huì)出現(xiàn)高血糖，如甲狀腺功能亢進(jìn)、垂體前葉嗜酸性細(xì)胞腺瘤、腎上腺皮質(zhì)功能亢進(jìn)、嗜鉻細(xì)胞瘤、垂體前葉嗜堿性細(xì)胞機(jī)能亢進(jìn)癥等。

此外，如顱外傷、顱內(nèi)出血、腦膜炎等引起的顱內(nèi)壓增高刺激血糖中樞也可導(dǎo)致高血糖。

（2）低血糖：空腹血糖濃度低于3.0mmol/L。

①生理性或暫時(shí)性低血糖：饑餓、劇烈運(yùn)動(dòng)、注射胰島素后，妊娠和服用降糖藥后等都會(huì)導(dǎo)致低血糖。腦組織首先對(duì)低血糖作出反應(yīng)，表現(xiàn)為頭暈、心悸、出冷汗和饑餓等癥狀，嚴(yán)重時(shí)可發(fā)生低血糖昏迷。

②病理性低血糖：胰島β細(xì)胞發(fā)生器質(zhì)性病變，胰島素分泌過(guò)多或治療時(shí)使用胰島素過(guò)多；對(duì)抗胰島素的激素分泌不足，如垂體前葉功能減退，腎上腺皮質(zhì)功能減退和甲狀腺功能減退而使生長(zhǎng)素、腎上腺皮質(zhì)激素分泌減少；嚴(yán)重的肝臟疾病患者由于肝臟儲(chǔ)存糖原及糖異生等功能低下，肝臟不能有效地調(diào)節(jié)血糖，這些均可導(dǎo)致低血糖。此外，糖原儲(chǔ)積癥、新生兒低血糖、自身免疫性疾病患者也易于出現(xiàn)低血糖。

能力檢測(cè)

一、單項(xiàng)選擇題

1.分光光度法（比色法）的理論基礎(chǔ)為（　?。?。

A.朗伯－比爾定律　　B.Nernst方程式　C.Rayleigh方程式

D.Heidelberger曲線　E.以上均不是

2.正常成人空腹血糖濃度（葡萄糖氧化酶法）參考值是（　?。?。

A.3～6mmol/L　B.3.89～6.11mmol/L　C.7.0mmol/L

D.9.0mmol/L　E.3.18～6.01mmol/L

3.下列關(guān)于低血糖的敘述錯(cuò)誤的是（　　）。

A.血糖濃度低于3.0mmol/L即可診斷

B.臨床癥狀主要是與交感神經(jīng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)機(jī)能的異常相關(guān)

C.經(jīng)典的診斷試驗(yàn)是72h禁食試驗(yàn)

D.由多種因素引發(fā)

E.糖尿病患者的發(fā)病率較高

4.高血糖的判斷標(biāo)準(zhǔn)是空腹血糖（葡萄糖氧化酶法）濃度（　?。?。

A.為3.89～6.11mmol/L　B.為8.9～10.0mmol/L　C.高于6.1mmol/L

D.高于7.0mmol/L　E.高于11.1mmol/L

5.目前，血糖濃度測(cè)定的常規(guī)方法是（　?。?。

A.葡萄糖脫氫酶法　　B.己糖激酶法　　　C.葡萄糖氧化酶法

D.鄰甲苯胺法　　　　E.6－磷酸葡萄糖脫氫酶法