1.氣相色譜法

1)原理

多不飽和脂肪酸(PUFA)是指含量?jī)蓚€(gè)或兩個(gè)以上雙鍵、碳原子數(shù)在16～22的直鏈脂肪酸，包括γ-亞麻酸(GLA)、二十碳五烯酸(EPA)及二十二碳六烯酸(DHA)。采用鹽酸水解法提取其油脂，并用CHCl3-KOH-CH3OH一步提取、甲酯化方法，運(yùn)用毛細(xì)管氣相色譜分析，以外標(biāo)法定量測(cè)定甲酯化樣品中多不飽和脂肪酸的含量。

2)儀器

①氣相色譜儀: 附氫火焰離子化檢測(cè)器;

②超級(jí)恒溫水浴: 精度( ±0.1℃)。

3)試劑

①氯仿;

②石油醚-苯(1+1);

③GLA，EPA和DHA的甲酯標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液: 采用Sigma公司標(biāo)準(zhǔn)品(GLA，cis-5，8，11， 14，17 - Pentaenoic Acid Methyl Ester，Approx. 99%，cis - 4，7，10，13，16，19 -Docosahxaenoic Acid Methyl Ester，Approx.98%)。準(zhǔn)確稱取0.100 g GLA，0.050 g EPA和0.100g DHA，用正己烷溶解并定容于10m L容量瓶，此標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液GLA濃度為10.0mg/m L， EPA濃度為5.0mg/m L，DHA濃度為10.0mg/m L;

④GLA，EPA和DHA的甲酯標(biāo)準(zhǔn)使用液: 將標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用正己烷稀釋成EPA濃度為1.00mg/m L，2.00mg/m L，3.00mg/m L，4.00mg/m L，5.00mg/m L，GLA和DHA濃度為2.00mg/m L，4.00mg/m L，6.00mg/m L，8.00mg/m L，10.00mg/m L。

4)操作步驟

(1)樣品處理

①直接酯化法: 將含有多不飽和脂肪酸的樣品進(jìn)行冷凍干燥，稱取1g樣品于具塞試管中，加入4m LCHCl3和2m L0.5mol/LKOH-CH3OH，劇烈振蕩2min; 并于50℃水浴保持10min(充氮?dú)獗Ｗo(hù))，劇烈振蕩2min; 加入3.6m L雙蒸水，再劇烈振蕩1min。過(guò)濾，靜置分層，取下層CHCl3相用于色譜分析。

②酸水解法: 取一定量樣品，以0.4mol/L鹽酸水解后，置于25m L具塞試管中，加入2m L石油醚-苯混合試劑，輕搖使溶解后加入2m L0.5mol/LKOH-CH3OH，于室溫酯化10～15min后水洗，靜置分層后取上層有機(jī)相用于色譜分析。

(2)色譜參考條件

色譜柱: HP-IN-NOWAX交聯(lián)聚乙二醇毛細(xì)管柱，0.25mm×30m，0.25μm;

升溫程序: 150℃→200℃(Δ=15℃/min，升至200℃后(保持15min)→240℃(Δ=2℃/min，升至240℃后持續(xù)2min);

氣體流速: 氫氣流速30m L/min，空氣流速150m L/min，氮?dú)饬魉?0m L/min;

溫度: 進(jìn)樣口260℃，檢測(cè)器260℃;

進(jìn)樣量: 1μL。

(3)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

用微量進(jìn)樣器準(zhǔn)確取1μL標(biāo)準(zhǔn)系列各濃度標(biāo)準(zhǔn)使用液注入氣相色譜儀，以測(cè)得的不同濃度的GLA，EPA和DHA的峰高為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

(4)樣品測(cè)定

準(zhǔn)確吸取1μL樣品溶液進(jìn)樣，測(cè)得的峰高與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較定量。

5)結(jié)果計(jì)算

式中: X——樣品中EPA，DHA或GLA的含量，μg/g;

V——樣品溶液的最終定容體積，m L;

c——測(cè)定液中EPA，DHA或GLA的濃度，μg/m L;

m——樣品質(zhì)量，g。

6)說(shuō)明及注意事項(xiàng)

①EPA和DHA回收率分別為(96.2±3)%和(95.8±4)%，精密度相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差分別為1.86%和2.11%。

②由于多不飽和脂肪酸極易被空氣所氧化，一般都要對(duì)其充氮?dú)饣蚣尤肟寡趸瘎┍Ｗo(hù)。

③在測(cè)定油脂中多不飽和脂肪酸的含量時(shí)，需將油脂抽提出來(lái)。經(jīng)典的方法是取干燥研磨的樣品于索氏提取器中以非極性有機(jī)溶劑抽提。而采用魏氏鹽酸水解法來(lái)提取其油脂，樣品無(wú)需干燥，所需時(shí)間短，且油脂提取率較高，適合于微生物油脂的提取。

2.分光光度法

1)原理

在室溫條件下樣品皂化，隨后在鹽酸作用下生成脂肪酸，具有順，順1，4-二烯結(jié)構(gòu)(即n-3，n-6系列的脂肪酸)的脂肪酸被酶促氧化，產(chǎn)生的氧化酸在最大吸收波長(zhǎng)(約235nm)下測(cè)定吸光度，同時(shí)做樣品空白試驗(yàn)，計(jì)算樣品中多不飽和脂肪酸的含量。

2)儀器

①離心機(jī);

②水浴鍋;

③紫外分光光度計(jì);

④分析天平。

3)試劑

①0.5mol/LHCl溶液;

②氫氧化鉀-乙醇溶液: c(KOH) =0.5mol/L。

③儲(chǔ)備液: 稱取65 g氫氧化鉀(86%氫氧化鉀)溶于約80 m L水中，冷卻后稀釋至100m L; 臨用前吸取5m L儲(chǔ)備液用體積分?jǐn)?shù)95%的乙醇稀釋至100m L。

④1.0mol/Lp H9.0的硼酸鉀緩沖液: 稱取61.9g硼酸和25.0g氫氧化鉀(86%氫氧化鉀)加熱攪拌溶于約800m L水中，冷卻至室溫，測(cè)定p H，如有必要，可用HCl或KOH溶液調(diào)p H為9.0，然后用水稀釋至1000m L。

⑤0.2mol/Lp H9.0的硼酸鉀緩沖液: 將200m L1.0mol/Lp H9.0的硼酸鉀緩沖液用水稀釋至1000m L，并冷卻。

⑥脂肪氧化酶稀釋液。

a.脂肪氧化酶: 酶的活力至少為50000U/mg［一個(gè)酶的活力單位(U)定義為實(shí)驗(yàn)條件下，每分鐘可氧化1.2×10-4μmol亞油酸所需的酶量］。

在凍干狀態(tài)下，于-18℃或更低的溫度保存時(shí)，該酶在數(shù)年內(nèi)都是穩(wěn)定的。

b.儲(chǔ)備液: 稱取相當(dāng)于650000U酶活的酶溶于10m L冰冷的0.2mol/L硼酸鉀緩沖液中，該儲(chǔ)備液在-18℃或更低的溫度下可長(zhǎng)期保存。

c.工作液: 將2m L儲(chǔ)備液和8m L冰冷的0.2mol/L硼酸鉀緩沖液混合。

⑦脂肪氧化酶滅活液: 吸取數(shù)毫升脂肪氧化酶稀釋液至試管中，并保證無(wú)液滴粘附在試管壁上。將試管浸入沸水浴中加熱至少5min，稀釋液的液面應(yīng)低于沸水浴的液面。

⑧參比油: 如葵花籽油或棉籽油，已知多不飽和脂肪酸含量(用氣相色譜法準(zhǔn)確測(cè)得，并以參比油的質(zhì)量分?jǐn)?shù)表示)，并假定其全為順，順1，4-二烯結(jié)構(gòu)的脂肪酸。

⑨氮?dú)? 純度不低于99.5%。

4)操作步驟

(1)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

在分析試樣時(shí)，建議與試樣平行分析已確知多不飽和脂肪酸含量的參比油，以核對(duì)分析步驟。

(2)試樣的皂化

稱取50～200mg試樣，精確至0.1mg，于100m L容量瓶中。用移液管吸取10m L氫氧化鉀-乙醇溶液至試樣的容量瓶中，用氮?dú)庵脫Q容量瓶中的空氣。加塞，放置暗處，皂化至少4h，間歇搖動(dòng)容量瓶使內(nèi)容物混勻。

如果樣品的熔點(diǎn)高于室溫，可將裝有樣品的容量瓶(加塞)置于50℃的水浴中加熱數(shù)分鐘，以加速皂化。

(3)測(cè)試液的制備

①皂化后，用適當(dāng)?shù)囊埔汗芟蛉萘科恐屑尤?0m L1.0mol/L的硼酸鉀緩沖液10m L0.5 mol/L的HCl溶液，加水稀釋至刻度。輕輕搖勻，盡量避免產(chǎn)生泡沫。如果沉淀產(chǎn)生，離心分離除去沉淀。

②用移液管吸取容量瓶中溶液1m L(或1m L離心分離的上清液)至另一100m L容量瓶(事先用氮?dú)獯迪?中，如果試樣中多不飽和脂肪酸含量少，應(yīng)吸取2～4m L試樣。

③用移液管吸取20m L1.0mol/L的硼酸鉀緩沖液至容量瓶中，加水至刻度。加塞混勻，盡量避免產(chǎn)生泡沫。這個(gè)步驟中輕微的渾濁不會(huì)影響后續(xù)的測(cè)定。

(4)標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

①標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備: 稱取相當(dāng)于含100mg多不飽和脂肪酸的參比油于100m L容量瓶中，精確至0.1mg，按照上述操作(2)及(3)中①的操作進(jìn)行中試樣的皂化處理并稀釋至刻度。

用移液管吸取10m L上述溶液至另一只100m L容量瓶中，加入18m L1.0mol/L的硼酸鉀緩沖液，用水稀釋至刻度。

用吸管吸取上述溶液分別為1m L，2m L，4m L，6m L，8m L，10m L溶液，分別置于6個(gè)100m L容量瓶中，均用0.2mol/L的硼酸鉀緩沖液稀釋至刻度。

②酶促氧化: 分別吸取0.1m L脂肪氧化酶稀釋液置于6支試管中，分別添加3m L相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)溶液，輕輕振蕩使溶液混勻。將試管靜置20min ～30min。

③補(bǔ)償溶液: 以0.1m L脂肪氧化酶滅活液代替脂肪氧化酶稀釋液來(lái)制備樣品補(bǔ)償溶液。

④繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線: 用石英比色皿，在235nm處測(cè)定吸光度，以補(bǔ)償溶液調(diào)節(jié)零點(diǎn)。以吸光度與已知組成的參比油計(jì)算所得不飽和脂肪酸的質(zhì)量作圖。

(5)測(cè)定

①酶促氧化: 吸取1m L脂肪氧化酶稀釋液至試管中，再吸取3m L測(cè)試液加到試管中，輕輕振蕩使溶液混勻。將試管靜置20～30min。

②分光光度計(jì)測(cè)定: 用石英比色皿，在235nm處測(cè)定樣品吸光度，以補(bǔ)償溶液調(diào)節(jié)零點(diǎn)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算脂肪酸的含量。

5)結(jié)果計(jì)算

式中: X——樣品中多不飽和脂肪酸的含量，g/100g;

m0——樣品的質(zhì)量，mg;

m1——根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算的多不飽和脂肪酸的質(zhì)量，mg;

V——從容量瓶中吸取液體的體積，m L。

6)說(shuō)明及注意事項(xiàng)

①本法適用于n-3，n-6系列多不飽和脂肪酸含量的測(cè)定，不適用于n-8，n-9系列多不飽和脂肪酸及含有支鏈脂肪酸含量的測(cè)定。

②脂肪氧化酶的活力如果偏低會(huì)導(dǎo)致結(jié)果偏低，而過(guò)高活力的酶制劑不會(huì)比活力在50000U/g～100000U/g酶制劑得到更好的結(jié)果。

③當(dāng)所取試樣中多不飽和脂肪酸的含量在10～80mg時(shí)，所測(cè)吸光度在0.07～0.5之間。

④在測(cè)試液制備時(shí)，皂化后，得到皂的稀釋液。泡沫中皂的濃度要高于液體本體中皂的濃度，當(dāng)溶液從一個(gè)容量瓶轉(zhuǎn)移到另一個(gè)容量瓶時(shí)，如果有泡沫粘附在移液管上，可能導(dǎo)致轉(zhuǎn)移了未知過(guò)量的脂肪酸。

⑤酶促氧化過(guò)程可在具塞分光光度計(jì)比色杯中進(jìn)行，以免在測(cè)量吸光度前再將溶液轉(zhuǎn)移到比色杯中。

⑥酶促氧化過(guò)程中試管中樣品的處理很重要。將內(nèi)容物初次混合后，不要再進(jìn)一步混合，進(jìn)一步混合會(huì)導(dǎo)致標(biāo)準(zhǔn)溶液、樣品補(bǔ)償溶液及測(cè)試溶液的吸光度增加。此外，如果比色杯中溶液一旦倒掉，再裝入其他溶液，則不能核對(duì)該測(cè)量值是否正確。溶液處理過(guò)程中造成吸光度增加的原因尚無(wú)法解釋，因此要確保分析步驟一致。

⑦以補(bǔ)償溶液調(diào)節(jié)零點(diǎn)時(shí)，可以補(bǔ)償由于樣品中原有的共軛二烯酸產(chǎn)生的吸光度。樣品溶液的補(bǔ)償吸光度應(yīng)以水為參比進(jìn)行核對(duì)，如果與測(cè)試液相比，此值太高，將使精密度降低。