脂肪源性干細(xì)胞
有學(xué)者認(rèn)為,脂肪來源的基質(zhì)細(xì)胞可表現(xiàn)出向多種細(xì)胞分化的潛能,一是脂肪組織中本身存在多種分化潛能限定的前體細(xì)胞,如前成骨細(xì)胞、前成肌細(xì)胞和前脂肪細(xì)胞;二是其他組織來源的干細(xì)胞(如血管周細(xì)胞、周圍血中的間充質(zhì)干細(xì)胞);三是以上2種細(xì)胞群的混合物。切除的脂肪組織經(jīng)消化后離心形成的細(xì)胞層含有前脂肪細(xì)胞,能夠分化為脂肪細(xì)胞,因此觀察到的脂肪細(xì)胞分化可能由于前脂肪細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化的結(jié)果,而不是多能干細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化的結(jié)果。但是加工過的脂肪吸取物(processed lipoaspirate,PLA)與MSCs類似,都能夠向成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、成肌細(xì)胞和軟骨細(xì)胞分化,而且PLA表達(dá)的CD抗原與MSCs類似。單克隆的細(xì)胞具有向成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、成肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞和軟骨細(xì)胞分化的能力,證實(shí)脂肪組織中確實(shí)存在干細(xì)胞。
一、ADSCs生物學(xué)特征
(一)形態(tài)和生長特點(diǎn)
細(xì)胞呈平行排列,漩渦樣生長,細(xì)胞為梭形,胞質(zhì)和核仁豐富。300ml的脂肪組織經(jīng)處理可常規(guī)產(chǎn)生(2~6)×108個(gè)ADSCs細(xì)胞,經(jīng)過多次傳代(10~20代),細(xì)胞的增殖速度無明顯減慢,衰老和死亡細(xì)胞所占比例也很少,表明脂肪組織蘊(yùn)含豐富的ADSCs細(xì)胞,且細(xì)胞體外擴(kuò)增能力很強(qiáng),易于傳代培養(yǎng)。
(二)免疫表型
其免疫表型與已經(jīng)報(bào)道的BMSCs相似。用流式細(xì)胞儀和免疫組化方法研究發(fā)現(xiàn),體外培養(yǎng)的ADSCs細(xì)胞可表達(dá)如下蛋白:①黏附分子。它始終表達(dá)tetraspan蛋白(CD9)、整合素β1(CD29)和α4(CD49d),還表達(dá)細(xì)胞間黏附分子1(ICAM-1,CD54)、endoglin(cd102)、血管細(xì)胞黏附分子(VCAM、CD106)及活化的淋巴細(xì)胞黏附分子(ALCAM,CD166)。但不表達(dá)神經(jīng)細(xì)胞黏附分子(NCAM,CD56)、細(xì)胞間黏附分子3(ICAM-3,CD50)、整合素αb(CD11b)和β2(CD18)及內(nèi)皮選擇蛋白(E-selectin,CD62)。②分子受體??杀磉_(dá)透明質(zhì)酸鹽(CD44)和轉(zhuǎn)鐵蛋白(CD71)的受體。③細(xì)胞外基質(zhì)蛋白和糖蛋白。ADSCs能生成Ⅰ型膠原、骨橋蛋白、ostenectin、Thy-1(CD90)和MUC-18(CD146)。④肌蛋白。能表達(dá)平滑肌細(xì)胞內(nèi)的肌動(dòng)蛋白和波形蛋白。⑤造血細(xì)胞標(biāo)記。不表達(dá)造血細(xì)胞標(biāo)志物CD14、CD31或CD45。⑥補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白。確定能表達(dá)衰變加速因子(CD55)和補(bǔ)體蛋白;⑦組織相容性抗原:表達(dá)Ⅰ類組織相容性蛋白HLAABC,而不表達(dá)Ⅱ類蛋白HLA-DR。
二、ADSCs分化潛能
(一)向成骨細(xì)胞分化
誘導(dǎo)培養(yǎng)基是往DMEM培養(yǎng)基中加入10%胎牛血清、0.1μmol/L地塞米松、50μmol/L維生素C、10mmol/Lβ-甘油磷酸鈉。培養(yǎng)2周后約有50%的細(xì)胞表達(dá)堿性磷酸酶,在培養(yǎng)板中有鈣化斑。
(二)向脂肪細(xì)胞分化
誘導(dǎo)培養(yǎng)基是含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中加入0.5mmol/L異丁基甲基嘌呤(isobutyl-methylxanthine,IBMX)、1μmol/L地塞米松、10μmol/L胰島素和200μmol/L吲哚美辛、33μmol/L生物素、17μmol/L泛酸鹽,培養(yǎng)2周后部分細(xì)胞分化為脂肪細(xì)胞,即使長時(shí)間培養(yǎng),ADSCs也會(huì)維持這種分化能力。不用誘導(dǎo)分化劑也有少數(shù)ADSCs分化為脂肪細(xì)胞。
(三)向軟骨細(xì)胞分化
誘導(dǎo)培養(yǎng)基是含1%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基,加入6.25μg/ml胰島素、10ng/ml TGF-β、0.1μmol/L地塞米松、6.25μg/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白和50nmol/L維生素C,誘導(dǎo)分化后的細(xì)胞表達(dá)Ⅱ型膠原,阿立新藍(lán)染色陽性,多次傳代培養(yǎng)后仍維持向軟骨細(xì)胞分化的能力。
(四)向成肌細(xì)胞分化
誘導(dǎo)分化的培養(yǎng)基是含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中加5%馬血清、0.1μmol/L地塞米松、50μmol/L氫化可的松。分化成肌細(xì)胞的比例為總細(xì)胞的12%左右。誘導(dǎo)一段時(shí)間,培養(yǎng)皿中出現(xiàn)多核的細(xì)胞,早期分化的細(xì)胞表達(dá)肌源性決定因子(myogenic determination factor1,MyoD1),終末分化融合的骨骼肌細(xì)胞表達(dá)肌球蛋白。
(五)向神經(jīng)細(xì)胞分化
人類ADSCs在氮胞苷的誘導(dǎo)下能夠分化為神經(jīng)細(xì)胞,表達(dá)神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志物,ADSCs移植到側(cè)腦室,能夠移行到腦的不同區(qū)域,廣泛分布。大腦中動(dòng)脈栓塞后,移植的ADSCs更容易向損傷部位移行,并且能夠改善動(dòng)物模型的疾病癥狀,分化的細(xì)胞可以表達(dá)神經(jīng)細(xì)胞的相關(guān)蛋白。早期分化的細(xì)胞能夠表達(dá)巢蛋白和神經(jīng)元特異性烯醇化酶,而晚期表達(dá)神經(jīng)微絲200。對(duì)恒河猴脂肪組織來源干細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn),在無血清培養(yǎng)基和bFGF、EGF、BDNF(brain-derived neurotrophicfactor)的誘導(dǎo)下,細(xì)胞能夠形成類似神經(jīng)干細(xì)胞的神經(jīng)球,貼壁后分化為神經(jīng)細(xì)胞。與骨髓基質(zhì)細(xì)胞相比,脂肪組織來源的細(xì)胞更容易向神經(jīng)細(xì)胞分化。對(duì)小鼠的ADSCs的研究證明,它能夠表達(dá)神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞表型,可表達(dá)γ-氨基丁酸、谷氨酸受體NR-1和NR-2亞單位、GAP-43、突觸蛋白Ⅰ和電壓控制型鈣通道(voltagegated calcium channels),分化的細(xì)胞可對(duì)谷氨酰胺激動(dòng)劑5-NMDA(N-methyl-D-aspartate)的刺激發(fā)生反應(yīng)。
(六)向內(nèi)皮細(xì)胞分化
人類皮下脂肪組織來源的非脂肪基質(zhì)細(xì)胞在體外能夠分泌VEGF、HGF、TGF-β,在缺氧條件下培養(yǎng)細(xì)胞時(shí),VEGF的分泌增加5倍。在用缺氧條件下獲得的ADSCs進(jìn)行條件培養(yǎng)時(shí),能夠明顯促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖,抑制內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。新分離的人脂肪組織的基質(zhì)血管層(stromal vascular fraction,SVF)含有大量CD34(+)、CD133(+)和ABCG2(+)細(xì)胞,而且部分CD34(+)細(xì)胞可以分化表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物CD31,免疫磁珠分選CD34(+)/CD31(-)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)這種細(xì)胞在一定條件下可以分化為內(nèi)皮細(xì)胞。在后肢缺血小鼠動(dòng)物模型的實(shí)驗(yàn)中,靜脈注射CD34(+)/CD31(-)細(xì)胞使缺血肢體的血流和毛細(xì)血管密度增加,移植細(xì)胞參與新生血管的生成,證明人類SVF中CD34(+)/CD31(-)的群體細(xì)胞具有內(nèi)皮祖細(xì)胞(干細(xì)胞)的性質(zhì),對(duì)于缺血性疾病的治療有一定的應(yīng)用價(jià)值。去分化的成熟人類脂肪細(xì)胞在體外可以很快獲得內(nèi)皮細(xì)胞表型,分化為內(nèi)皮細(xì)胞,移植到體內(nèi)參與血管生成,促進(jìn)裸鼠缺血肢體的新血管生成,形成血管樣結(jié)構(gòu),結(jié)果提示內(nèi)皮細(xì)胞與脂肪細(xì)胞可能擁有共同的祖細(xì)胞(干細(xì)胞)。
(七)向心肌細(xì)胞分化
人類ADSCs在大鼠心肌細(xì)胞提取物的誘導(dǎo)下可以分化為心肌細(xì)胞,表達(dá)心肌細(xì)胞的標(biāo)志物sarcomeric-α肌球蛋白、肌動(dòng)蛋白、結(jié)蛋白和心肌肌鈣蛋白Ⅰ、縫隙連接蛋白43(connexin 43),可見雙核和有斑紋的細(xì)胞,并可見細(xì)胞的隨機(jī)跳動(dòng)。小鼠的ADSCs在不用5-氮胞苷的誘導(dǎo)條件下也可分化為心肌樣細(xì)胞,具有心肌細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu),表達(dá)心肌細(xì)胞的特異標(biāo)志物,早期的培養(yǎng)還可以檢測(cè)到細(xì)胞的起搏活動(dòng),腎上腺素激動(dòng)劑能夠增加細(xì)胞的收縮節(jié)律,而膽堿能激動(dòng)劑會(huì)降低細(xì)胞的收縮節(jié)律。
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