第二節(jié)　基因治療的主要步驟

基因治療的主要步驟包括：①克隆治療基因；②選擇合適的靶細胞；③通過基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)將治療基因?qū)氚屑毎?；④目的基因在受體細胞內(nèi)的有效表達。

一、治療基因

治療基因的選擇來源于人類對疾病分子病理的認識以及基因功能的研究。當(dāng)選擇一個基因作為治療對象時，必須對基因的序列、結(jié)構(gòu)及其產(chǎn)物的功能等要有詳盡的了解。治療基因可以是與缺陷基因相對應(yīng)的特定的正常基因，也可以是與缺陷基因無關(guān)但有治療意義的基因，如細胞因子基因等。選擇的治療基因應(yīng)已被克隆，而且必須置于合適的啟動子的控制之下，編碼基因的信號肽序列必須完整，只有這樣，目的基因才能夠完整地、穩(wěn)定地整合，并能適時適量地表達。目前，已用于臨床試驗的治療基因僅集中于少數(shù)基因，尤其是對極大部分多基因疾病，如惡性腫瘤、高血壓、糖尿病、冠心病、神經(jīng)退行性疾病的致病基因還有待闡明。這就有賴于人類基因組計劃，尤其是功能基因組學(xué)的發(fā)展。這不僅限于這些致病基因的發(fā)現(xiàn)，同時也包括已知和目前尚未知功能的基因的表達調(diào)控序列的確定，以及其相互作用規(guī)律的闡明。

二、合適的靶細胞

人體中的細胞有兩大類：一類是生殖細胞；另一類是體細胞。

體細胞基因治療的影響只限于某個體的當(dāng)代，只涉及患者本人體細胞的基因轉(zhuǎn)變，但總有一些種類的細胞是難以實施基因治療的，并且該種基因治療不能從根本上解決向后代的傳遞問題。體細胞基因治療在技術(shù)上易于施行，無倫理學(xué)障礙，是目前公開允許進行的基因治療方式。

生殖細胞基因治療是將外源的正?；蜣D(zhuǎn)移到患者的生殖細胞中，其治療是矯正了個體的所有細胞，使其后代發(fā)育成正常個體并世代傳遞。理論上講可以從根本上解決后代的遺傳缺陷問題，但目前的技術(shù)還遠遠未能做到避免外源基因的插入引起的生殖細胞基因突變，以至于對生殖細胞的操作很有可能使后代產(chǎn)生另外的缺陷。即使沒有醫(yī)學(xué)技術(shù)上的問題，很多社會倫理方面的問題目前也很難解決。比如，到底哪些基因可用于治療？人類是否可以利用遺傳工程隨心所欲地改造自己？或者說我們是否可以隨意“創(chuàng)造”一個個體？這些問題目前都還在爭論中。大多數(shù)國家和地區(qū)對此問題都保持著謹慎態(tài)度。

選擇靶細胞時最好選擇組織特異性細胞，比如目的基因在哪種組織細胞中有表達就選擇哪種組織。目前常用的靶細胞主要有以下幾種。

1.骨髓細胞，尤其是造血干細胞　骨髓細胞是多種細胞的前體，有較多的遺傳病或多或少都涉及源自骨髓的細胞，有可能應(yīng)用經(jīng)基因工程改造過的骨髓細胞來治療一些并不直接與骨髓細胞有關(guān)的遺傳病。骨髓又是體內(nèi)重要的造血組織，骨髓內(nèi)有多種造血細胞處于不同的發(fā)育階段，對于那些與造血組織相關(guān)的疾病，可以將治療基因轉(zhuǎn)移至造血干細胞，則可以使轉(zhuǎn)移基因終生存在于所有造血細胞內(nèi)。但干細胞含量很少，僅占骨髓細胞的0.1%左右。

2.成纖維細胞，尤其是皮膚成纖維細胞　成纖維細胞具有長期自我更新能力，并且易于進行體外培養(yǎng)和高效轉(zhuǎn)染。通過皮膚活檢，很容易得到患者本身的原代皮膚成纖維細胞，當(dāng)經(jīng)基因轉(zhuǎn)移的細胞再輸回患者體內(nèi)時可以避免免疫排斥反應(yīng)。

3.肝細胞　肝臟是重要的代謝器官，許多遺傳病都是由于肝臟特異的基因產(chǎn)物缺陷所引起；肝癌又是發(fā)病率較高的惡性腫瘤。此外，肝細胞作為移植細胞還可在異位發(fā)揮功能。所以，以肝細胞作為受體細胞進行基因治療是基因研究的熱點之一。但肝細胞取材不易。

4.肌細胞　骨骼肌細胞的突出特點是可以進行直接體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移，即將真核表達載體直接注射入骨骼肌。骨骼肌細胞中的成肌細胞，壽命較長適合于長期的外源基因表達，以及來源豐富容易取出和培養(yǎng)，具有一定的分裂功能，因而對反轉(zhuǎn)錄病毒載體的感染很敏感，容易移植。成肌細胞中分泌的外源基因表達產(chǎn)物，不僅對骨骼肌組織產(chǎn)生一些生物效應(yīng)，而且可以進入血液以影響全身。因此，對一些全身性疾病，具有重要的應(yīng)用價值。

另外，血管平滑肌細胞增殖是許多血管性疾病的重要病理變化，在心血管疾病的治療中，抑制血管平滑肌細胞的增殖是一個重要的研究領(lǐng)域。在體外實驗中，已有將自殺基因和抑癌基因?qū)胙芷交〖毎谐晒σ种蒲鼙谠龊竦膱蟮馈Ｑ芷交〖毎梢赃M行體外培養(yǎng)，經(jīng)遺傳操作后再送回血管。

5.淋巴細胞　外周血淋巴細胞中的T細胞擔(dān)負著重要的免疫功能，也很容易從體內(nèi)取出和回輸，可以在體外進行培養(yǎng)和擴增，并對目前常用的幾種轉(zhuǎn)移方法都具有一定的敏感度。

6.血管內(nèi)皮細胞　將基因?qū)胙軆?nèi)皮細胞，可以直接向血液中分泌基因表達產(chǎn)物。

7.腫瘤細胞　對目前的絕大多數(shù)的基因轉(zhuǎn)移方法都比較敏感，特別是腫瘤細胞始終處于旺盛的分裂狀態(tài)，所以可以進行高效率的轉(zhuǎn)導(dǎo)。

8.其他細胞　許多實質(zhì)器官的細胞也是基因治療較為常用的細胞類型，除了肝細胞外，還有心肌細胞、脾細胞。但實質(zhì)器官細胞的取出要借助外科手術(shù)，至少也是活檢，移植較為困難。

三、基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)

參見本章第三節(jié)。

四、目的基因在受體細胞內(nèi)的有效表達

基因治療應(yīng)以目的基因在受體細胞內(nèi)的表達水平及其調(diào)控近似于體內(nèi)正常的外環(huán)境為目的，也就是說，基因治療的有效性有賴于目的基因在特定組織、細胞中適時、適當(dāng)水平的表達，即控制性表達而非隨機失控性表達，表達產(chǎn)物才能發(fā)揮正確的治療作用。所以，如何有效地調(diào)控外源基因在體內(nèi)的表達，使其控制在適當(dāng)水平，是決定基因治療是否成功的關(guān)鍵。過度的表達不僅對治療疾病不利，甚至有可能引起致命的毒副反應(yīng)。

正由于基因表達調(diào)控在基因治療中起重要作用，而目前的技術(shù)水平還達不到可以在體內(nèi)精細調(diào)控基因表達，所以首先進行的基因治療都是選擇那些目的基因表達在導(dǎo)入人體后即使不進行精確地調(diào)控也能達到較好的基因治療效果的病種，比如一些單基因遺傳病。隨著技術(shù)的進步，預(yù)期總會有一天，許多病種都可以用基因治療作為治療手段之一。