12．2．1　幾種常用的分離和測定同工酶的方法

12．2．1．1　電泳

區(qū)帶電泳是最常用的分離同工酶的方法，采用高分辨率的支持物如淀粉凝膠或聚丙烯酰胺凝膠可獲得滿意的分離效果。近年來采用等電聚焦電泳還可以分出一級結構相同而空間構象不同的酶分子。酶分離后，再加入底物保溫，并用類似于組織化學的特殊方法來鑒定底物的減少或產物的生成。但是能被電泳法分離的不一定是同工酶，酶帶的數目也不一定代表同工酶的數目，因為某些酶蛋白可與電泳介質中的帶電物質結合，改變其分子大小及電荷，從而改變電泳速度。例如：LDH可與血清中的免疫球蛋白A或G結合而形成相對分子質量從300×10³到1　000×10³、等電點從pH為6．3到7．2的各條酶帶。過去在人血清電泳時發(fā)現的“巨淀粉酶”（macroamylase）實際上是淀粉酶和免疫球蛋白A的復合物。這些復合物都不是同工酶。相反，兩種電泳速度不同的同工酶，如其中一個和帶電的小分子物質結合后，其電泳速度恰巧與另一個相等，則兩種同工酶在電泳時分離不開而只出現一條酶帶。故不能單憑電泳來鑒定是否為同工酶。

12．2．1．2　層析

大多數同工酶的相對分子質量比較接近，而表面電荷差別較大，故一般較少用分子篩層析而用離子交換層析來分離同工酶。采用陽離子或陰離子樹脂則取決于同工酶的等電點及其在不同pH值時的穩(wěn)定性。離子交換層析可用于純化或制備不同的同工酶，但其分辨率低于電泳。

親和層析是利用同工酶和相應的配基（如底物、輔酶、抑制劑、抗體等）親和力不同的原理，將同工酶混合物通過固相的配基，再用緩沖液分別將吸附程度不同的同工酶洗脫下來，即可達到分離的目的。此法特異性高，特別適用于分離和提純同工酶。

12．2．1．3　熱穩(wěn)定性

利用同工酶熱穩(wěn)定性的不同，將含有兩種同工酶的混合樣品加熱處理后，可以較特異地破壞其中一個不耐熱的同工酶。因此測定加熱前后的活性，可在不需分離的情況下分別計算出兩種同工酶的活性。此方法簡易，但準確性較差。

12．2．1．4　動力學

原級同工酶對底物的特異性、親和力或對各種抑制劑和激活劑的敏感性常不相同，這些動力學的差別常被用于測定或區(qū)別同工酶。例如，ALD同工酶有三種純聚體即肌型（A4）、肝型（B4）和腦型（C4），它們對底物1，6－二磷酸果糖（fructose diphosphate，FDP）及1－磷酸果糖（fructose 1－phosphate，F1P）的親和力差異很大。A4催化FDP和F1P分解的速度比值為50，即幾乎不能作用于F1P；而B4的比值為1，催化兩種底物分解的速度相等，C4介于A4和B4之間。在A4和B4混合的樣品中，分別測定FDP或F1P為底物時的活性，即可大致推測樣品中A4和B4的相對比值。LDH同工酶也有不同的底物專一性，如心肌中的LDHB4（或LDHH4）對α－羥丁酸的親和力遠大于肝臟或骨骼肌中的LDHA4（或LDHM4）。

又如己糖激酶（hexokinase，HK）和葡糖激酶又稱Ⅳ型己糖激酶（glucokinase，GK）是催化葡萄糖受ATP磷酸化的同工酶，HK對葡萄糖的Km約為0．1mmol·L^－1；而GK則高至10mmol·L^－1左右。當HK和GK共存時，在2．5mmol·L^－1葡萄糖濃度時測得的酶活性減去對照值后主要為HK的活性；而在100mmol·L^－1葡萄糖時測得的活性則為HK和GK活性的總和，由此可算出GK的活性。動力學法雖然簡單，不必分離同工酶即可分別測定，但不易找到只作用于同型同工酶的抑制劑或激活劑。

12．2．1．5　免疫法

多基因位點的原級同工酶與復等位基因同工酶或次級同工酶比較，其氨基酸組成常有較大的差別，故有不同的抗原性。利用純化的同工酶在異種動物中制備抗血清，再加至同工酶的混合樣品中，該抗體即可與相應的同工酶抗原形成免疫復合體而沉淀，而將另一型免疫性不同的同工酶留在溶液中，從而達到分離的目的。有時沉淀時可回收全部酶活性，如各型堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP）同工酶，測定沉淀的活性即可定量。如果抗體將酶活性全部抑制，沉淀中免疫復合物沒有活性，如各型CK同工酶，則測定上清液中的殘余活性即為另一型未被沉淀的同工酶的活性。利用放射免疫法還可以精密而特異地測定微量的同工酶。此外，免疫法還可以區(qū)別組織中某一同工酶活性的增高是由于激活還是酶蛋白增多的結果，因后者有抗原量的增加，可用免疫定量法（如火箭電泳法）測定出來，而前者的酶蛋白抗原并不增加。